• Enzymatic activity
• Homology modelling
• HPLC analysis
• PET degradation
• PETase

Il polietilene tereftalato (PET) è ampiamente utilizzato per la produzione di prodotti di plastica, soprattutto nell’industria del packaging. Essendo scarsamente degradabile, il PET si è accumulato nell’ambiente, creando così un problema globale, in quanto è causa di danno all’ecosistema e alla salute umana. Dal momento che le tecnologie convenzionali di riciclo sono state inefficienti nello sviluppare una strategia di degradazione che sappia tutelare l’ambiente, ora si pensa che l’uso di enzimi per il biorisanamento possa essere la chiave vincente nella risoluzione di questo problema. In tal scenario, lo scopo di questo studio è stato quello di produrre e caratterizzare una nuova PETase da Streptomyces SM14 che al momento è priva di una precisa caratterizzazione funzionale e strutturale.
Un sistema di espressione eterologa è stato disegnato per la produzione di PETase BK010828 (Uniprot code: A0A679PDB4) in Escherichia coli BL21 (DE3). La proteina è stata prodotta e purificata con successo usando la cromatografia IMAC e 162 mg di proteina sono stati ottenuti da 1L di coltura, registrando così una resa del 3,6%. Successivamente, è stata condotta un’analisi di peptide-mass fingerprinting con ESI-ORBITRAP-MS per confermare che la proteina purificata avesse la corretta sequenza aminoacidica.
Le PETase sono enzimi che hanno l’interessante capacità di rompere i legami esterei che si trovano nelle lunghe catene di PET e di conseguenza viene rilasciata una varietà di prodotti come mono-2-idrossietil tereftalato (MHET), bis(2-idrossietil) tereftalato (BHET), acido tereftalico (TPA) e glicole etilenico. La caratterizzazione funzionale è stata quindi basata sulla detection e quantificazione di questi prodotti di digestione mediante analisi in HPLC. L’attività degradativa di PETase BK010828 è stata valutata su differenti substrati come plastica post-consumo, PET pellet e PET in polvere, i quali mostrano differenze per quanto riguarda il grado di cristallinità e la quantità di superficie esposta. Attraverso questa analisi è stato provato che l’enzima è attivo e che le condizioni ottimali in cui farlo lavorare sono a pH 9 e temperatura 40 o 50°C.
Infine, la struttura dell’enzima è stata ottenuta mediante homology modelling. Il modello 3D mostra una proteina monomerica costituita da 9 besta-strand, che formano un foglietto beta parallelo, e 7 alfa-eliche, dando origine così ad un’architettura di tipo 3-layer sandwich. Il modello è stato confrontato con la struttura cristallografica di PETase da Ideonella sakaiensis, che al momento è l’enzima che mostra l’attività più elevata nei confronti del PET, e inoltre sono state indagate le similarità e le differenze strutturali.

Polyethylene terephthalate (PET) is widely used in plastic products, especially in the packaging industry. However, because it is non-degradable, it has accumulated in the environment, posing a global problem as it harms the ecosystem and human health. While conventional recycling and remediation technologies have been inefficient in developing an environmentally friendly degradation strategy, the use of enzymes for bioremediation purposes is showing more promise. In this scenario, this study aims to produce and characterise a new PETase from Streptomyces SM14, which currently lacks precise functional and structural characterisation. A heterologous expression system was designed for PETase BK010828 (Uniprot code: A0A679PDB4) production in Escherichia coli BL21 (DE3). The protein was successfully produced and purified using IMAC chromatography obtaining 162 mg of protein from 1L of culture broth, resulting in a yield of 3.6%. Then, ESI-ORBITRAP-MS for peptide-mass fingerprinting was performed to confirm that the purified protein had the correct aminoacidic sequence. PETase enzymes have the remarkable ability to break down the ester bonds found in the long PET chain. As a result, a variety of products, including Mono-(2-hydroxyethyl)terephthalic acid (MHET), Bis-(2-hydroxyethyl)terephthalic acid (BHET), terephthalic acid (TPA) and ethylene glycol (EG) are released. Consequently, the functional characterisation has been based on the detection and quantification of these digestion products through HPLC analysis. The degradative activity of PETase BK010828 has been evaluated on different substrates such as post-consumer plastic, PET pellet and PET powder, which exhibit differences in the degree of crystallinity and the amount of exposed surface. Through this analysis, it has been proved that the enzyme is active and it performs best at pH 9 at a temperature of either 40°C or 50°C. Last, the structure of the enzyme has been suggested through homology modelling. The 3D model shows a monomeric protein made of 9 beta-strands, that form a parallel beta-sheet, and 7 alpha-helixes that originate a 3-layers sandwich architecture. Finally, the model has been compared to the crystallographic structure of PETase from Ideonella sakaiensis, which is currently the PET-degrading enzyme that displays the greater activity, highlighting the similarities and differences.