Riassunto analitico
La ceroido lipofuscinosi neuronale infantile (LINCL) è una patologia genetica ereditaria di accumulo lisosomiale caratterizzata da deterioramento psicomotorio progressivo e brevi aspettative di vita. E’ una patologia rara causata da una mutazione del gene CLN2 codificante per la proteasi lisosomiale tri-peptidil-peptidasi-1 (TPP1) che porta all’assenza di TPP1 all’interno dei lisosomi. L’accumulo progressivo di ceroide all’interno delle cellule della corteccia e del cervelletto provoca tossicità neuronale ed atrofia cerebellare e corticale. Attualmente sono disponibili solo terapie palliative e per tale motivo, lo sviluppo di una terapia di sostituzione enzimatica (ERT), potrebbe rappresentare una innovativa soluzione per la cura della LINCL. Tale terapia prevede la somministrazione dell’enzima TPP1, il quale, per esercitare l’effetto terapeutico, dovrebbe attraversare la barriera ematoencefalica (BEE) e raggiungere il compartimento lisosomiale delle cellule nervose della corteccia e del cervelletto dove si accumula la ceroide tossica. L’applicazione più semplice della ERT prevede la somministrazione intravenosa dell’enzima libero. Tale approccio è associato però a una serie di svantaggi come il fatto che TPP1 venga facilmente degradato nel sangue, non riesca ad attraversare la BEE e raggiungere le cellule neuronali. L’incapsulazione di TPP1 in nanoparticelle può aiutare ad ovviare tali problemi perché rende l’enzima più stabile nella circolazione sanguigna proteggendolo nella struttura delle nanoparticelle; inoltre, la superficie esterna delle nanoparticelle potrebbe essere funzionalizzata per garantire l’attraversamento della BEE e si potrebbe ottenere un sistema a rilascio prolungato che riduca la frequenza di somministrazione. Per tali ragioni, l’obiettivo generale di questo progetto è di utilizzare la nanotecnologia per migliorare la terapia LINCL attraverso l’incapsulazione di TPP1 in nanosistemi. Sono stati stabiliti i seguenti parziali obiettivi: 1-Progettazione, sviluppo e caratterizzazione di nanoparticelle polimeriche incapsulanti TPP1 prodotte con il sistema Total Recirculation One Machine System (TROMS); 2-Progettazione, sviluppo e caratterizzazione di nanoparticelle lipidiche incapsulanti TPP1 prodotte con due metodi: il metodo della omogeneizzazione a caldo ed emulsione multipla. Le nanoparticelle prodotte con questi metodi sono state caratterizzate per dimensione, indice di polidispersività (PDI) e potenziale Z utilizzando il Nanosizer. La morfologia delle nanoparticelle è stata analizzata attraverso la microscopia elettronica a scansione e a trasmissione (SEM e TEM), mentre l’efficienza di incapsulazione (EE%) attraverso Western Blot. Le nanoparticelle polimeriche prodotte con successo attraverso il TROMS risultavano di dimensione <300 nm, PDI <0.3 e potenziale Z negativo. Tali nanoparticelle polimeriche posseggono alta EE% (circa 90%). Attraverso l’analisi SEM e TEM è stata confermata una morfologia sferica e l’assenza di pori superficiali. Le nanoparticelle lipidiche prodotte con successo attraverso il metodo della omogeneizzazione a caldo sono invece caratterizzate da dimensione <100 nm e da una distribuzione dimensionale monomodale, potenziale Z negativo ed elevata efficienza di incapsulazione. Infine, le nanoparticelle lipidiche prodotte con successo attraverso il metodo delle emulsioni multiple hanno mostrato una distribuzione dimensionale omogenea compresa tra 150 e 200 nm. In tutti i casi l’incapsulazione dell’enzima all’interno dei nanosistemi non ha avuto effetti sulla dimensione e sulla carica superficiale delle nanoparticelle. In conclusione i nostri dati mostrano che TPP1 può essere efficientemente incapsulato in nanoparticelle polimeriche e lipidiche. In assenza di terapie alternative contro LINCL, lo sviluppo di nanoparticelle incapsulanti TPP1 potrebbe essere una delle terapie più promettenti.
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Abstract
The Late Infantile Neuronal Ceroid Lipofuscinoses (LINCL) is a genetic inherited lysosomal storage disorder characterized by progressive intellectual and motor deterioration and early death. LINCL is a rare disease that is caused by the mutation of the gene CLN2 that codes for an unspecific lysosomal protease called tripeptidyl-peptidase-1 (TPP1). The consequence of CLN2 gene mutation is the lack of TPP1 within the lysosomes. The irreversible and progressive accumulation of ceroid, mainly in the cells of the cortex and cerebellum, leads to neuronal toxicity which is manifested by cerebellar and cortical atrophy. Up to now, only palliative treatments for LINCL are available. An interesting therapeutic approach for LINCL is Enzyme Replacement Therapy (ERT) in which TPP1 should be administered. However, to exert a therapeutic effect TPP1 has to cross the blood brain barrier (BBB) and reach the lysosomal compartment of the neuronal cells in the cortex and cerebellum where the toxic ceroid accumulates. The easiest way to apply ERT is the administration of the free enzyme intravenously. However, such administration leads to many disadvantages (TPP1 is easily degraded in blood, it does not cross the BBB to reach the neuronal cells). A new approach that implies the formulation of TPP1 in nanoparticles can help to overcome these drawbacks: entrapped enzyme would be stable in the blood stream since it would be protected inside the structure of the nanoparticles, the external surface of nanoparticles could be modified to allow BBB crossing and could be obtained a sustained release of TPP1 over time that would reduce the number of administrations. Thus, taking into account all the above, the general objective of this project is to use nanotechnology to improve LINCL therapy through the entrapment of TPP1 in nanosystems. The following partial objectives have been established: 1-To design, develop and characterize polymeric nanoparticles entrapping TPP1 by Total Recirculation One Machine System (TROMS); 2-To design, develop and characterize lipidic nanoparticles entrapping TPP1 by two methods: hot melting homogenization and multiple-emulsion. The nanoparticles produced using the three methods were characterized in terms of size, polydispersity index (PDI) and Z-potential using a Nanosizer. The morphology of the nanocarriers were analyzed by Scanning Electron Microscopy (SEM) and Transmission Electron Microscopy (TEM) and TPP1 entrapment efficiency (EE%) were quantified by Western Blot. Polymeric nanoparticles were successfully prepared by TROMS. This technique enables the production of nanoparticles smaller than 300 nm, with PDI values smaller than 0.3 indicating a narrow size distribution and with Z-potential values negative. Moreover, high EE% of TPP1 (around 90%) was obtained using TROMS encapsulation method. SEM and TEM analysis revealed that nanoparticles were dispersed as individual particles with a well-defined spherical shape and without pores. On the other hand, lipidic nanoparticles were successfully prepared by hot melting homogenization technique with a size below 100 nm. The particle distribution size of lipidic nanoparticles was homogeneous with a Z-potential negative and high entrapment efficiency. Then, lipidic nanoparticles were also successfully prepared by multiple-emulsion technique. Nanoparticles showed mean sizes with a narrow size distribution ranging from 150 to 200 nm. In all the cases, the encapsulation of TPP1 has no effect either on the size or surface charge of nanoparticles. In conclusion, our data demonstrated that TPP1 can be efficiently entrapped both in polymeric and lipidic nanoparticles. Although further studies are needed to demonstrate the efficacy of TPP1-loaded nanoparticles in in vitro and in vivo models of the disease. In the absence of alternative therapies against LINCL, the development of TPP1 nanoparticles is one of the most promising alternative treatments.
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