Riassunto analitico
L’obesità è uno dei più importanti problemi di salute del ventunesimo secolo. Essa è definita come un eccessivo accumulo di grasso dovuto a un aumentato introito calorico correlato ad una mancanza di esercizio fisico. L’obesità è un disturbo complesso ad eziologia multifattoriale causata non solo da una stile dietetico non corretto ma anche da fattori genetici e ambientali. Questa patologia è correlata a diverse comorbilità come l’ipertensione, il diabete di tipo 2, le malattie epatiche a eziologia non alcolica (NAFLD) e altre patologie che portano ad un aumento della mortalità e ad un’elevata spesa sanitaria. Diversi dati supportano l’esistenza di uno stretto legame tra l’eccesso di peso corporeo e la patogenesi delle NAFLD anche se i meccanismi di tale corrispondenza non sono ancora chiariti. Scopo di questo progetto è mettere a punto un modello animale di obesità indotta da dieta (DIO) nello Zebrafish utile per lo studio dello sviluppo di NAFLD in condizioni associate all’obesità. Lo Zebrafish è un eccellente modello sperimentale sia in biologia dello sviluppo che in ricerca biomedica. Esso ha riscontrato negli ultimi 15 anni sempre maggiori apprezzamenti ed è infatti un valido strumento per studiare le patologie umane. I vantaggi di questo organismo sono molti e tra questi possiamo enumerare un rapido sviluppo, embrioni trasparenti, semplice manipolazione genetica e cellulare. Inoltre, l’apparato gastrointestinale, il tessuto adiposo, la muscolatura scheletrica e metabolismo lipidico dello Zebrafish presentano una stretta omologia con la loro controparte umana. Nel nostro studio abbiamo ricreato un modello di obesità indotto da dieta nello Zebrafish prendendo come riferimento lo studio di Oka et al 2010. Prima di iniziare gli esperimenti i pesci sono stati pesati e misurati in lunghezza al fine di dividerli in gruppi omogenei per sesso, età e BMI. Questi gruppi sono poi stati assegnati a diversi protocolli di alimentazione (gruppo degli overalimentati e di controllo). Gli zebrafish nel protocollo di overalimentazione sono stati cibati tre volte a giorno con 60 mg Artemia a pesce, mentre quelli nel gruppo di controllo una volta al giorno con 5 mg Artemia a pesce. Per determinare la percentuale di cibo consumato i pesci sono alimentati in vasche da 1 litro e le Artemia sono contate prima e dopo il pasto. Il peso e la lunghezza di ogni pesce sono stati misurati settimanalmente per tutto il corso dello studio per monitorare l’andamento del BMI. Campioni di fegato sono stati prelavati a diversi tempi (1-6-12-24 settimane di trattamento) e utilizzati per analisi istopatologiche. Colorazioni con Ematossilina-eosina e con Oil-red O delle sezioni epatiche sono state eseguite per valutare l’accumulo di grassi a livello epatico nel corso delle settimane di trattamento. È interessante sottolineare che già dalle prime settimane abbiamo notato differenze tra i due gruppi di alimentazione sia a livello di crescita corporea (BMI) che a livello istopatologico. Poiché la mia tesi di laurea verte sullo sviluppo di un modello di obesità indotta da dieta nello Zebrafish, essa è principalmente focalizzata sui protocolli di alimentazione, preparazione del cibo, prelievo del tessuto epatico e messa a punto di metodi di colorazione per analisi istopatologiche. Gli esperimenti condotti sono stati disegnati con l’obiettivo anche di valutare l’impatto dell’età e del sesso nello sviluppo e della progressione dell’obesità e delle NAFLD alla luce del fatto che recenti studi hanno messo in evidenza una diversa suscettibilità nello sviluppare obesità tra topi di diverso sesso. I risultati descritti in questa tesi hanno come scopo quello di aumentare la conoscenza del modello animale di DIO nello Zebrafish; modello che potrà essere poi utilizzato come strumento per caratterizzare i meccanismi coinvolti nell’insorgenza e nello sviluppo di NAFLD.
|
Abstract
Obesity has emerged as one of the most serious public health in the 21st century. It is defined as abnormal or excessive fat accumulation due to a combination of excessive intake and lack of physical activity. It is a complex disorder with a multifactorial etiology that has been proven to involve not only diet, but also lifestyle, genetics and environment. Obesity is a serious condition associated with several comorbidities such as hypertension, type 2 diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and other diseases that cause mortality and high health-care expenditure. Several data support the existence of a close relationship between body weight excess and NAFLD pathogenesis even if this correlation is not yet completely understood. Aim of this project is to set up a Zebrafish model of DIO (dietary induced-obesity) that can be use to investigate the development of liver damage in obesity-associated conditions. The zebrafish (Danio rerio), a relatively newer animal model, has been described as an excellent experimental model not only in developmental biology, but also in biomedical research. In the last 15 years, there has been a growing appreciation for this vertebrate organism as a tool to study human disease. There are a lot of advantages of this model such as rapid external development, transparent embryos, easy genetic and cellular manipulation. Furthermore, the digestive organs, the adipose tissues and the skeletal muscles of Zebrafish are physically arranged in a manner similar to their human counterparts. Remarkable similarities also exist in lipid metabolism between zebrafish and mammals. In our study we established a zebrafish model of DIO (Oka T. et al. 2010). Zebrafish were divided into two dietary groups (overfeeds and control groups). Before being classified, the fishes were weighed and measured in order to create groups with similar BMI (body mass index), gender and age. The overfed groups were fed three times a day with 60 mg Artemia/day while the control groups were fed once a day with 5 mg Artemia. To determine the percentage of eaten Artemia, Zebrafish were fed in 1L tank and the Artemia were counted before and after adding the fishes to the tank. The body weight and length of zebrafish were measured weekly throughout the study in order to evaluate the evolution of BMI. Liver samples were collected at different time point (1-6-12-24
weeks of treatment) and were analyzed by histopathology. Hematoxylin-eosin and Oil Red O staining on liver section were carried out to evaluate lipid and fat accumulation in the liver tissue at different weeks of treatment. Remarkably, already starting from the first week of treatment some differences both in BMI and histopathological features were visible.
As my dissertation was aimed to develop a Zebrafish DIO model, I focused my attention on the setting up of protocols for feeding zebrafish, hatching of Artemia, zebrafish dissection, liver isolation and processing and staining of liver tissue for histopathological analysis. The experiments were designed in order to evaluate the differential impact of gender and age in the development of obesity and NAFLD development and progression, accordingly with recent observation that male mice are more susceptible to obesity than female mice. The results described in this dissertation would lead to a main improvement in the characterization of the zebrafish DIO model that could further be use in order to characterize the pathophysiology and the progression of NAFLD in obesity associated conditions. This animal model could also be useful in order to identify putative pharmacological targets and to test novel drugs for the treatment of human obesity.
|
