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• Terapia genica

Negli ultimi anni la terapia genica ha rivoluzionato l’approccio classico alla medicina ampliandone gli orizzonti verso lo sviluppo di strategie terapeutiche innovative. Dopo il successo riscosso nel trattamento di malattie genetiche classiche, oggi è ampiamente utilizzata come approccio per la cura di patologie oncologiche, autoimmuni e cardiovascolari. Uno dei sistemi biotecnologici più studiati e vicini al tema della terapia genica è il CRISPR/CAS9 (Ribonucleoprotein, RNP): un complesso enzimatico che, associato ad una molecola di RNA guida, consente di eseguire precise operazioni di editing sul materiale genetico. Nonostante il potenziale terapeutico, il complesso RNP non può essere somministrato come tale, pertanto una delle sfide più interessanti nel campo della terapia genica è quella di riuscire a definire un protocollo per la sintesi di sistemi di veicolazione non virali.
In questo studio è stato ottimizzato il protocollo di sintesi di nanoparticelle lipidiche (LNPs) finalizzate al trasporto e rilascio del complesso RNP. A causa del costo proibitivo, nella fase di screening l’RNP è stato sostituito da β-Glucosidasi (β-Glu), un enzima modello più economico e con massa molecolare e carica elettrica paragonabili al RNP. Sulla base di precedenti ottimizzazioni, alcuni parametri tecnici sono stati mantenuti costanti, come il rapporto in peso enzima:lipidi, mentre altri parametri formulativi, quali la composizione della fase organica, Total Flow Rate (TFR) e Flow Rate Ratio (FRR), sono stati ottimizzati. Inizialmente è stato condotto uno screening su 24 formulazioni contenenti colesterolo, DSPC, DPPC e DOPE in diverse quantità. Mediante l’uso di una pompa per siringhe collegata ad un chip microfluidico, LNPs vuote sono state formulate e caratterizzate in termini di dimensioni, indice di polidispersione, potenziale zeta e stabilità alla conservazione. Le 16 formulazioni più promettenti sono state formulate anche caricate con β-Glu per simularne il comportamento al caricamento del RNP.
I risultati hanno evidenziato che il FRR migliore per ottenere particelle riproducibili era 1:3, ottenendo LNPs omogenee e stabili alla conservazione a 4°C per 7 giorni. Cinque formulazioni sono state marcate con il fluoroforo DOPE-Rhod e testate su cellule staminali primarie per valutarne la citotossicità e l’uptake. Questi saggi hanno dimostrato che la formulazione SC presenta un profilo di tossicità sicuro e un buon uptake (intorno al 20% a 100µg/mL).
La transizione verso un sistema di produzione di LNPs automatico (ANP) ha consentito una riduzione del volume di formulazione, necessario per poter lavorare con le minime quantità richieste di complesso RNP. Al fine di ottenere un’efficienza d’incapsulazione maggiore di RNP, carico negativamente, è stato aggiunto in diverse percentuali del lipide cationico DOTAP. Questo ha portato all’ottenimento di LNPs cationiche omogenee e stabili, con efficienza d’incapsulazione di β-Glu nell’intervallo tra il 4% e 11%. Grazie alla marcatura con rodamina, è stato possibile verificare il profilo di sicurezza e di uptake in cellule staminali primarie, da cui è emerso che la formulazione SC 1:1 DOTAP 5% ha registrato l’uptake maggiore (intorno al 87% a 100µg/mL) con minima tossicità.
In questo progetto sono state sviluppate LNPs neutre e cationiche per la veicolazione del complesso RNP a cellule staminali. La formulazione ottimizzata SC 1:1 DOTAP 5% ha mostrato bassa tossicità, buona efficienza di incapsulazione e buon uptake in cellule staminali primarie, dimostrando di essere la più promettente per la veicolazione dell’RNP. Potendo contare su un metodo produttivo scalabile e automatizzato, la formulazione scelta sarà caricata con l’RNP per verificarne le caratteristiche chimico-fisiche e l’efficacia in vitro.

In recent years, gene therapy has revolutionized classical approaches leading towards the development of novel therapeutic strategies. Thanks to its early success in treating previously untargetable genetic diseases, it's now widely used to tackle several types of pathologies, such as cancer, autoimmune, and cardiovascular disorders. CRISPR/Cas9 (Ribonucleoprotein, RNP) represents an innovative gene therapy-associated tool; when associated with a single-guide RNA, it permits highly accurate genome editing protocols for long term expression or gene knockdown. The development of a non-viral delivery system able to encapsulate CRISPR/CAS9, coupled with a scalable formulation method, represents an interesting future for gene therapy. In this study, the microfluidic formulation of lipid nanoparticles was optimized to load a model enzyme (β-glucosidase) which presents a similar size (135 kDa) and electric charge compared to the RNP complex. Based on previous optimizations, some technique-related parameters were kept constant, such as enzyme:lipid weight ratio, while the lipidic compositions, the total flow rate (TFR), and the flow rate ratio (FRR) were varied. First, the organic phase composition was investigated using a mixture of cholesterol, DSPC or DPPC, and DOPE in ethanol. These phases were used to synthesize 24 empty LNPs using a syringe pump coupled with a toroidal microfluidic chip. Size, PDI, and zeta potential results were used as discriminants to determine the acceptability of the formulations. Among these, 16 of the most promising formulations were used to create β-Glucosidase loaded-LNPs. Enzyme loading reduced the number of acceptable formulations, indicating the significant influence of lipid composition on LNPs characteristic. DOPE-Rhodamine was added to selected promising formulations to evaluate the uptake and cell viability of the LNPs via in vitro studies on stem cells by our collaborators at the University of Padova. From these assays, the formulation SC (containing cholesterol 50%, DSPC 25% and DOPE 25%) showed the best results in terms of uptake when dosed at 100µg/mL, around 20%. Trials to transition from the syringe pump to the ANP allowed a reduction of sample volume, but these still require further investigation due to the new formulation conditions and the difference in chip used. In order to achieve a higher encapsulation efficiency, samples were formulated with the addition of the cationic lipid DOTAP at different molar percentages. These organic phase lipid mixtures were employed in the preparation of cationic β-Glucosidase-loaded-LNPs, which were analyzed for size and PDI. Encapsulation efficiency characterization suggested SC DOTAP 5% and 10% (FRR 1:1 TFR 6 mL/min) to be the most promising formulations, showing an EE% of 4% and 11% respectively. DOPE-Rhod was added in the same quantity to SC DOTAP 5% - 10% formulations to perform further in vitro-analyses about cell viability and uptake on stem cells. These studies revealed that, among all the samples, the formulation SC 1:1 DOTAP 5% showed the highest uptake result, around 87% when dosed at 100µg/mL. This lipid formulation is very promising due to its proven non-toxicity and its good encapsulation efficiency and uptake results. Coupled with the possibility of obtaining a large scale production thanks to microfluidic approach, this sample will be used to formulate RNP-loaded LNPs, to verify their physicochemical characteristics and in vitro effectiveness.