Riassunto analitico
La retinite pigmentosa (RP) è uno dei disturbi retinici ereditari più comuni che causano cecità. Questa condizione è caratterizzata da un'ampia eterogeneità genetica e porta ad una degenerazione dei bastoncelli seguita dalla degenerazione dei coni, provocando nei casi più gravi la completa perdita della vista. La degenerazione dei fotorecettori era classicamente associata alla morte cellulare tramite la via apoptotica. Tuttavia, ricerche recenti hanno dimostrato che la pathway di segnalazione della guanosina monofosfato ciclico (cGMP) svolge un ruolo cruciale nella morte cellulare, attivando le proteine chinasi cGMP-dipendenti (PGK). La retina dei mammiferi esprime tre diverse isoforme di PKG: PKGIα, PKGIβ e PKGII, ma il contributo di ciascuna di esse durante il processo di morte cellulare è ancora sconosciuto. Lo scopo di questo progetto è downregolare l'espressione dell'isoforma PKGII nella linea cellulare murina 661W-A11, una linea di progenitori di fotorecettori. La generazione di cellule prive di PKGII sarà utile come modello in vitro per studiarne la funzione ed il ruolo durante i meccanismi di morte cellulare. Inoltre, tale modello potrà essere usato per testare la specificità di composti diretti verso le diverse isoforme di PKG. A tale scopo sono state utilizzate due diverse strategie: la tecnologia CRISPR/Cas9 ed il sistema di interferenza dell'RNA. Mentre il primo approccio per realizzare il knock out di PKGII ha mostrato alcune limitazioni dovute alla sequenza degli esoni del gene Prgk2 unito ad un possibile off-target del gRNA, la strategia di interferenza dell'RNA basata sull'integrazione genomica di uno shRNA, ha consentito di superare questi problemi bersagliando direttamente l'mRNA. Abbiamo ottenuto cellule down regolate per PKGII. Tuttavia, è necessario aumentare il numero di cellule knock out di PKGII migliorando il processo di selezione con puromicina delle cellule esprimenti lo shRNA per Prkg2.
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Abstract
Retinitis pigmentosa (RP) is one of the most common hereditary retinal disorders causing vision impairment. This condition is characterized by wide genetic heterogeneity and leads to the degeneration of rods photoreceptors followed by cones and ultimately to complete loss of vision. Photoreceptor degeneration has been classically associated with apoptotic cell death, however recent findings showed that cyclic guanosine monophosphate (cGMP) signaling plays a crucial role in cell death, activating cGMP-dependent protein kinases (PGKs). The mammalian retina expresses three different PKG isoforms: PKGIα, PKGIβ and PKGII, although the distinct contribution of each single PKG isoform during the cell death process is still unknown. The aim of this project was to downregulate the expression of the PKGII isoform in the 661W-A11 murine cell line of photoreceptor progenitors. The generation of cells lacking the PKGII will be useful as an in vitro model to study its function and role during cell death mechanisms. Moreover, this in vitro model could also be useful to investigate the specific target of drugs designed for different PKG isoforms. For this purpose, two different strategies were used: the CRISPR/Cas9 technology and the RNA interference system. While the first approach for knocking down the Prkg2 gene encoding PKGII showed limitations, due to the sequence of the exons of the gene and a possible unpredicted off-target of the gRNA, the RNA interference strategy, based on genomic integration of a shRNA, allowed us to overcome these problems, directly targeting the mRNA. We were able to obtain downregulated cells, however an improvement of the selection with puromycin of infected cells containing the shRNA targeting Prkg2 is needed to increase the yield of PKGII knock out cells.
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