Riassunto analitico
L’obesità è una patologia complessa e multifattoriale che dipende da fattori genetici e ambientali. La sua principale causa è l’accumulo di grasso nell’organismo dovuto a una dieta ipercalorica e troppo energetica rispetto alle esigenze dell’individuo.L’obesità è ritenuta una condizione rischiosa per la salute a causa della sua associazione con malattie cardiovascolari, diabete di tipo 2, NAFLD e alcuni tipi di cancro.È quindi necessaria un’approfondita ricerca su questo argomento e nel campo delle comorbidità legate all’obesità, essendo quest’ultime quelle che provocano i primi sintomi che un paziente nota. Il mio gruppo è interessato allo studio dell’associazione tra obesità e malattie del fegato grasso, note come NAFLD, definizione che abbraccia un largo spettro di condizioni partendo dalla semplice steatosi epatica passando per la steatoepatite non alcolica,la fibrosi,la cirrosi e arrivando infine al carcinoma epatocellulare(HCC).La connessione tra obesità e NAFLD è nota da tempo, le NAFLD sono infatti considerate la manifestazione epatica della sindrome metabolica, benché il meccanismo che le collega non sia ancora completamente descritto.Per approfondire lo studio di questa correlazione, il mio gruppo ha sviluppato un modello animale in Danio rerio (zebrafish) che recentemente è stato molto apprezzato in gastroenterologia e nella ricerca sul metabolismo lipidico.I suoi principali vantaggi stanno nella facilità e praticità di utilizzo proprie dei modelli più semplici (Drosophila e Caenorhabditis), associate al fatto che, essendo un vertebrato, lo zebrafish è molto simile ai mammiferi per piano di sviluppo dell’organismo e processi metabolici.In letteratura sono descritti diversi modelli genetici di patologie epatiche ma per comprendere l’influenza dell’obesità sullo sviluppo del danno epatico abbiamo utilizzato un modello di obesità indotto da dieta, che meglio rappresenta la situazione di un paziente obeso.Il nostro approccio sperimentale prevede l’impiego di un protocollo di overalimentazione, in accordo con Oka et al. 2010, che consiste nell’alimentare 3 volte/die gli zebrafish, sia maschi che femmine, con un elevata quantità di Artemia, un cibo ricco di grassi, per un totale di 60 mg di Artemie/die. Il gruppo di controllo è invece nutrito 1 volta/die con 5 mg di Artemie.Ogni pasto è somministrato in contenitori da 1 litro, dove la quantità di artemie viene misurata prima del trasferimento dei pesci e dopo 2 ore, quando i pesci sono rimossi.Settimanalmente gli zebrafish vengono pesati e misurati in lunghezza per calcolare l’indice di massa corporea(BMI).La durata degli esperimenti è di 24 settimane.I risultati ottenuti mostrano che già dopo le prime settimane di trattamento ci sono differenze evidenti tra i due gruppi: i pesci iperalimentati mostrano un sensibile incremento del BMI e iniziano a sviluppare steatosi epatica ed epatomegalia. Poiché il nostro scopo è quello di analizzare l’espressione di geni coinvolti nello sviluppo del danno epatico in soggetti obesi, abbiamo messo a punto un esperimento di Real Time PCR sull’RNA estratto dai fegati degli zebrafish trattati a tempi diversi.I geni sono stati scelti per il loro ruolo in metabolismo lipidico, infiammazione e HCC (es. SREBP1, i PPAR, il recettore della leptina, APO-IV, TNFa, IL-6).Ogni coppia di primers è stata testata sia per l’efficienza di amplificazione utilizzando curve standard sia per la specificità mediante l’analisi delle curve di melting.Nel mio lavoro di tesi illustrerò i risultati che sono stati ottenuti finora e che sono principalmente focalizzati alla messa a punto del modello animale e dei protocolli sperimentali.Questo modello animale verrà utilizzato in successivi esperimenti per valutare i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo di NAFLD e dell’evoluzione in cirrosi ed HCC in condizioni associate all’obesità.
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Abstract
Obesity is a complex multifactorial disease which depends on genetic and environmental factors.It consists of an extra accumulation of fat in the organism mostly due to an extra-intake of calories with diet. It is defined as a highly risky condition for health because of the strong association between obesity and other pathologies such as cardiovascular diseases, type 2 diabetes, non alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and certain types of cancer. In the light of this, it is clear that deep research is needed on this argument and especially in the field of comorbidities, because they provoke symptoms that actually a patient notices more easily than a weight increase.My study has focused its research on the link between obesity and NAFLD, a wide spectrum of conditions, which goes from simple hepatic steatosis up to non-alcoholic steatohepatitis, fibrosis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The association between NAFLD and obesity has been known for long. NAFLD is considered as the liver manifestation of metabolic syndrome, even if the mechanism which links them is still not completely understood. In order to enhance the current understanding of this association, we decided to develop an animal model in Danio rerio, commonly known as zebrafish. It is a small teleost that recently has been largely appreciated in gastroenterology and lipid research because it puts together the possibility to maintain a high number of individual in limited space, the feasibility and the tractability of simple models as flies and worms but, being a vertebrate, is more similar to mammals in regard to body plan, metabolic processes, lipid metabolism and liver structure. Several genetic liver disease model has been developed in zebrafish until now, but to understand the influence of obesity on NAFLD we used a dietary model that may resemble a more realistic situation if compared with a human patient. Our experimental approach consists of an overfeeding protocol that was developed in our laboratory in accordance with previous literature by Oka T et al. 2010. Briefly, male and female zebrafish were fed 3 times a day with a high quantity of Artemia, a high-lipid content fish food, for a total of 60 mg Artemia/day, whereas the control groups were fed once a day with 5 mg Artemia/. Each meal was dispensed in 1-L tanks, where the quantity of Artemia were measured both before transferring the fishes in the tanks and after 2 hours, when they were removed. Once a week zebrafish were weighted and their length were measured in order to calculate the Body Mass Index (BMI). Each experiment lasted 24 weeks. Interestingly, after the first weeks of treatment some differences were already evident, overfeeding fish had an appreciable increase in BMI and started developing hepatic steatosis and hepatomegaly. Since our aim was to analyze the expression of genes involved in the progression of liver disease in obese associated condition, a Real Time PCR was set up on RNA extracted from liver samples collected at different time point. Investigated genes have been chosen on the base of their importance in lipid metabolism, inflammation and HCC (i.e.SREBP1, PPARs, Leptin Receptor, APO-IV, TNFa, IL-6). Each pair of primers was tested for the efficiency of amplification through analysis of standard curves and challenged for specificity with melting curves analysis. In my composition I will illustrate the results that were obtained until now that are mainly focused on the set up of the experimental model and protocols.Further experiment will be carried out on this animal model in order to evaluate the molecular mechanisms potentially involved in the occurrence and in the progression of NAFLD to cirrhosis and HCC in condition associated with obesity.
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