Riassunto analitico
La Leucemia Linfatica Cronica (LLC) è un disordine linfoproliferativo dalle cause sconosciute, caratterizzato dall’accumulo di piccoli linfociti B monoclonali, localizzati in varie parti del corpo. La variabilità di questa leucemia rende difficile capirne gli aspetti patogenetici, e probabilmente sono diversi i fattori che contribuiscono a provocarla o peggiorarne la prognosi. Molti studi hanno preso in considerazione l’espressione dei microRNA (miRNA), piccole molecole di RNA non codificante a singolo filamento, la cui funzione consiste nella modulazione post-trascrizionale dell’espressione genica. È ormai nota la loro aberrante espressione nell’ambito della LLC, ma solo un limitato gruppo di queste molecole presenta una reale azione su target coinvolti nella patogenesi della malattia, e rimane ancora molto da capire sul motivo della loro alterata espressione e cosa questo comporti funzionalmente. Nell’ambito della LLC, inizialmente il nostro gruppo di ricerca, ha identificato Angiopoietina-2 (Ang-2) come molecola ad espressione estremamente variabile nei pazienti con LLC, dimostrando che una sua alta espressione è predittiva di una prognosi più aggressiva, in grado di indurre una maggiore angiogenesi e favorire lo sviluppo tumorale. Alti livelli del suo messaggero, inoltre, si riscontrano in pazienti LLC con i geni delle immunoglobuline (Ig) non mutate, a prognosi sfavorevole. Dati questi presupposti, lo scopo di questo lavoro è stato quello di valutare l’espressione dei miRNA nei pazienti con LLC, in relazione con i livelli di Ang2, in modo da individuare il loro ruolo nella modulazione dell’espressione di questo gene. Lo studio è stato condotto su campioni di RNA estratto dalle cellule CD19+ purificate da 15 pazienti, di cui 7 con Ig mutate e 8 con Ig non mutate, data la strettissima associazione tra l’espressione di Ang2 e lo stato mutazionale delle Ig. Siamo partiti mettendo in evidenza l’espressione dei miRNA nei 15 pazienti, utilizzando la metodica del microarrays. Lo studio ha permesso di evidenziare il miR-155 più espresso nei pazienti non mutati rispetto a quelli mutati. Anche i livelli messaggeriali di Ang2, misurati in Real-Time PCR, risultavano più alti nel primo gruppo. I livelli del miR155, inoltre, si confermavano più alti anche nel sottogruppo di 5 casi con Ig non mutate ed Ang2 alta rispetto a quello di 5 casi con Ig mutate e Ang2 bassa, suddivisi sulla base di un cut-off ricavato in precedenti studi. L’aver trovato un’associazione tra alta espressione di questo miRNA e livelli più alti di Ang2, ci ha fatto ipotizzare che il miR155 non agisse direttamente su Ang2, ma piuttosto inibisse un target a sua volta in grado di inibire Ang2. I target già validati sperimentalmente per questo miRNA, comprendevano 2 molecole che sembravano dei putativi inibitori di Ang2, e tra queste, MECP2 presentava caratteristiche e funzioni che lo rendevano un ipotetico target del miR155. Abbiamo individuato una correlazione negativa tra i suoi livelli e quelli di Ang2, e la sua espressione era più bassa nei pazienti con Ig non mutate e Ang2 alta rispetto ai pazienti con Ig mutate e Ang2 bassa. In tutti i casi analizzati in Western Blot, inoltre, abbiamo osservato anche la presenza della proteina MECP2 e delle due isoforme proteiche di Ang2. Per testare in vitro il funzionamento della ipotetica cascata miR155-MECP2-Ang2, abbiamo trasfettato il miR155 in una linea cellulare di LLC, con l’intento di silenziare l’espressione di MECP2 e provocare così un aumento dei livelli di Ang2. Le cellule così trasfettate, mostravano effettivamente un aumento dei livelli messaggeriali di Ang2 rispetto a quelle trasfettate con il miRNA CN, e questi risultati sembrano supportare, a livello messaggeriale, l’ipotesi che il miR155 provochi aumento dell’espressione di Ang2 tramite silenziamento di MECP2.
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