• cellule muscolari
• citotossicità
• Nanoparticelle
• palmitoiletanolamide
• rilascio del farmaco

I drug carriers sono sistemi di diversa natura, sviluppati per migliorare il rilascio dei farmaci, la loro biodisponibilità e l’emivita. Le nanoparticelle lipidiche (SLNs) sono sistemi costituiti da lipidi e da tensioattivi idrofili, mentre quelle polimeriche (NPs) sono preparate con materiali polimerici (come l'acido poli-lattico-co-glicolico o PLGA), in presenza di tensioattivi. Lo scopo di questo progetto di ricerca è stato sviluppare due tipologie di nanocarriers (lipidici e polimerici), con l'intento di veicolare Palmitoiletanolammide (PEA), un composto naturale antinfiammatorio.
La PEA è un'ammide di un acido grasso avente importanti effetti antinfiammatori, analgesici e neuro-protettivi; questi benefici le consentono di essere utilizzata in diverse aree terapeutiche, quali il trattamento di patologie immunitarie o infiammatorie. PEA può essere utilizzata per il trattamento della sarcopenia, una condizione patologica che porta al declino della funzionalità del muscolo scheletrico probabilmente a causa di un’esposizione cronica delle cellule staminali a citochine infiammatorie.
Nonostante i suoi vantaggi, PEA presenta una scarsa biodisponibilità e una breve emivita; per questo motivo, l'utilizzo di nanoparticelle polimeriche e lipidiche risulta essere vantaggioso.
Le SLNs sono state preparate attraverso la tecnica d’omogeneizzazione ad alta pressione, mentre quelle polimeriche mediante nanoprecipitazione. Entrambi i sistemi sono stati caratterizzati per quanto riguarda le loro dimensioni mediante l’uso della Photon Correletion Spectroscopy (PCS) e la morfologia con Microscopio a Forza Atomica (AFM) per le SLNs e Microscopio Elettronico a Scansione (ESEM) per le NPs. Per entrambi i carriers è stato valutato il caricamento (DL%) e rilascio del farmaco in vitro con HPLC. Infine, sulla linea cellulare muscolo-scheletrica C2C12, si sono valutate la citotossicità, mediante test MTT, e l'internalizzazione cellulare, mediante citofluorimetria e microscopio confocale. Lo studio di internalizzazione è stato realizzato utilizzando nanoparticelle rese fluorescenti con Red Nile.
Entrambe le nanoparticelle (SLNs e NPs) sono state ottenute con successo: le dimensioni risultavano pari a 300 nm per quelle lipidiche e 200 nm per le polimeriche. Le SLNs hanno mostrato un valore di DL% maggiore rispetto a NPs. Inoltre, analisi in vitro hanno rilevato un rilascio del farmaco dalle NPs più veloce rispetto a quello dalle SLNs, conseguenza del fatto che la maggior parte del farmaco è localizzato al di fuori della particella polimerica, evidenza confermata anche mediante analisi con ESEM. Per questo motivo, i test cellulari in vitro sono stati condotti solo su SLNs. Il test MTT ha rilevato una minima tossicità dopo un tempo d’incubazione di 12 h. Inoltre, il saggio di internalizzazione ha messo in evidenza che la percentuale di cellule fluorescenti era pari circa al 90%. Questi risultati sono stati confermati attraverso l'analisi con il microscopio confocale, il quale ha evidenziato la presenza massiva di nanoparticelle all'interno del citoplasma.
In conclusione, le SLNs sembrano essere un promettente sistema di veicolazione di PEA all'interno di cellule muscolo-scheletriche. La potenzialità di tali nanosistemi dovrà essere ulteriormente indagata, con lo scopo di valutare la capacità di rilasciare PEA all'interno del nucleo cellulare, dove è presente il recettore PPAR-, possibile responsabile dell’attività antinfiammatoria.

Drug nanocarriers are systems made of different materials, able to improve the delivery, the bioavailability and the half-life of drugs. Solid lipid nanoparticles (SLNs) are composed of different lipids and hydrophilic surfactants, while polymeric nanoparticles (NPs) are prepared with polymeric material (such as Poly-lactic-co-glycolic acid or PLGA, the most used one) in the presence of hydrophilic surfactants, too. The aim of this research project was to develop these two kinds of drug nanocarriers in order to deliver palmitoylethanolamide (PEA), a potential anti-inlammatory natural compound. PEA is a fatty acid amide with important analgesic, anti-inflammatory and neuroprotective effects, which can exert beneficial outcomes in inflammatory or immunizing pathologies, allowing it to be used in therapeutic areas. However, PEA suffer of poor bioavailability and short half-life, thus, the use of lipid or polymeric nanoparticles may be useful in order to overcome these important drawbacks. PEA-loaded nanoparticles can be applied for the treatment of Sarcopenia, a condition that could naturally occur during aging and which leads to a skeletal muscle size and function decline, whose most accredited cause seems to be linked to a chronic inflammation of satellite cells in muscle fibers. SLNs were prepared by using the hot homogenization technique, while the NPs were prepared by nanoprecipitation method. Both the nanocarriers were optimized and characterized in terms of size and size homogeneity (using Photon Correlation Spectroscopy), morphology (using Atomic Force Microscopy for SLNs and Environmental scanning electron microscope (ESEM) for NPs), drug loading (DL%) and in vitro drug release (using High Performance Liquid Chromatography for both carriers). Finally, cytotoxicity by means MTT test and internalization assays (using flow-cytometry and confocal microscopy) were performed on C2C12 muscular cells in order to evaluate both the cytotoxicity of the carriers and the ability of the nanoparticles to promote PEA up-take in the cells. The cell internalization assay was performed by using Nile Red labelled SLNs at the highest non-toxic concentration. Both the nanocarriers were successfully obtained, with a size of 300 nm and 200 nm for SLNs and NPs, respectively. The SLNs exhibited a higher value of DL% compared to the polymeric nanoparticles. Furthermore, the drug release study showed that the drug diffused from PLGA NPs more quickly than from SLNs, probably because the most part of drug was localized outer the particles, as the ESEM analysis highlighted. Thus, in vitro tests were performed using lipid nanoparticles (SLNs). In vitro MTT cellular assay of PEA-loaded SLN on C2C12 muscular cells showed a very low cytotoxicity after the overnight incubation. Moreover, cell internalization assay by flow cytometry indicates that the extent of the fluorescent cells was about 93% after the incubation with unloaded SLNs and 85% after incubation with PEA-loaded SLNs. These results were also confirmed by confocal microscopy, that demonstrated the presence of the labelled SLNs in the cytoplasm. In conclusion, SLNs demonstrated to be a promising tool for the delivery of PEA in muscular cell model. The potentiality of SLNs will be further investigate, in order to evaluate the SLNs ability to deliver PEA into the nucleus of muscular cell, bonding its most important target, namely the nuclear PPAR-alpha receptor, which is the principal responsible of the anti-inflammatory action.