Riassunto analitico
Il glutatione (GSH) è una molecola di grande interesse in campo enologico per il suo ruolo nel limitare l’ossidazione dei vini, incidendo positivamente sia sulla componente aromatica che sulla preservazione del colore. La sua concentrazione all’interno dei vini è variabile e regolata da diversi fattori, legati sia alle caratteristiche della materia prima che alla produzione da parte di agenti microbiologici quali i lieviti.
Lo scopo del presente lavoro è quello di incrociare un ceppo di Saccharomyces cerevisiae alto-produttore di GSH con un ceppo ad alta performance fermentativa per ottenere un nuovo individuo biologico che concili entrambi i tratti. L’utilizzo delle tecniche di breeding permette di muoversi nel campo non-OGM.
Abbiamo studiato la progenie monosporale del ceppo 21T2 (UMCC 855), ceppo genitore di Mo21T2-5 (UMCC 2581), alto-produttore di GSH commerciale, non incrociabile direttamente in quanto incapace di sporificare. Nove colture monosporali molibdato-resistenti sono state ottenute a partire dal ceppo 21T2. Dai nostri precedenti studi la molibdato-resistenza sembra correlata ad una elevata produzione di GSH. Tecniche di fingerprinting molecolare sono state utilizzate per verificare le differenze genetiche globali tra i ceppi ottenuti e ne è stato determinato il tipo sessuale.
Tra questi, 4 ceppi sono stati selezionati per la loro migliore crescita ad una concentrazione di molibdato incrementata rispetto a quella precedentemente applicata.
Parallelamente, una library di 82 cloni monosporali del ceppo commerciale IperR X PB2033_8 (UMCC 2592), caratterizzato da alto vigore fermentativo, è stata costruita. Venti di queste, derivanti dai 5 aschi con viabilità del 100%, sono state selezionate per la caratterizzazione fenotipica.
Sia per le monosporali derivate dal ceppo 21T2 sia per quelle derivate dal ceppo IperR X PB2033_8 è stata valutata la crescita su diversi tipi di terreni, basati su valori variabili di diversi agenti di stress e sulla presenza di indicatori. Questo screening ha avuto una duplice valenza, da una parte l’eliminazione di ceppi aventi caratteristiche indesiderate, dall’altra la selezione dei ceppi più vigorosi in contesto di fermentazione. Inoltre, un test di sporificazione su terreno agar acetato ha permesso di eliminare i ceppi incapaci di sporificare, quindi inapplicabili alle procedure di incrocio.
In base ai suddetti criteri abbiamo selezionato 4 ceppi resistenti al molibdato e 7 ceppi ad alto vigore fermentativo. Questi ceppi hanno subito un’ulteriore selezione basata su un test fermentativo in mosto sintetico. La produzione di GSH per le monosporali derivate dal 21T2 è stata misurata sia tramite una metodica HPLC che attraverso l’utilizzo di un kit enzimatico.
Incrociando i risultati delle fermentazioni e degli stress-test, è stato selezionato il ceppo più performante dal punto di vista fermentativo, IperR X PB2033_8_8C, e il miglior ceppo alto-produttore di GSH, 21T2_D41 (UMCC 2705). I due ceppi sono stati incrociati tramite tecnica spore-to-spore e la validazione dell’ibrido è avvenuta tramite l’amplificazione di regioni minisatellitari a lunghezza variabile (geni DAN4 e HSP150).
Una volta validato l’incrocio, il ceppo è stato applicato al test di sporificazione e ai test di crescita, alla stregua dei parentali. Esso ha mostrato tratti fenotipici paragonabili al parentale 21T2_D41 avendo tuttavia una migliore fitness ad alte concentrazioni di etanolo, oltre che una capacità sporigena migliore rispetto al ceppo IperR X PB2033_8C. Il passo successivo consisterà nell’applicazione del ceppo a fermentazioni su diverse varietà di mosto, al fine di valutarne la produzione di GSH in diversi contesti.
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