Riassunto analitico
Negli ultimi anni è aumentato l’interesse per i lieviti enologici in grado di produrre elevate quantità di glutatione (GSH) grazie alla sua capacità di controllare i danni ossidativi e i fenomeni di invecchiamento atipico nei vini, preservando quindi le caratteristiche organolettiche del prodotto e limitando l’impiego di anidride solforosa.
Sono state descritte diverse strategie di miglioramento genetico dei lieviti per l’ottenimento di ceppi alto produttori di GSH. In particolare, le strategie di evoluzione adattativa, ampiamente utilizzate in campo enologico, sono quelle che riscuotono il consenso dei consumatori, dato che non portano alla produzione di organismi geneticamente modificati.
Recentemente il gruppo di ricerca UMCC ha messo a punto una strategia di evoluzione adattativa per la selezione di tali ceppi, basata sulla formazione di ricombinanti attraverso tecniche di riproduzione sessuale e l’applicazione di uno screening rapido e altamente selettivo dei ricombinanti di interesse. In particolare, la resistenza al molibdato esavalente è stata utilizzata come carattere di selezione dei ceppi alto produttori di GSH.
Tramite questa strategia, a partire dal ceppo enologico di S. cerevisiae UMCC 855 (=21T2) è stato ottenuto un pool di 8 ceppi evoluti, tra i quali si è distinto il ceppo UMCC 2581 (=Mo21T2-5) per la sua capacità di produrre quantità di GSH molto più elevate rispetto al ceppo parentale.
Nella presente ricerca al ceppo UMCC 2581 è stata applicata una strategia di miglioramento genetico basata sulla ricombinazione mitotica in grado di fornire non una permutazione genica, ma nuovi alleli potenzialmente interessanti per il tratto fenotipico in esame. La scelta di questa strategia è basata sull’assunzione del fatto che il nostro ceppo di partenza possieda già la migliore combinazione allelica disponibile riguardo alla produzione di GSH e che ulteriori tecniche di ricombinazione sessuale non possano produrre ceppi migliorati per tale tratto fenotipico, ma solo causare una regressione verso i valori di produzione medi della popolazione.
Il ceppo UMCC 2581 è stato inizialmente sottoposto a stress selettivo in un terreno minimo addizionato di Mo(VI) 5mM, concentrazione che, da studi precedenti, era risultata essere limitante per la crescita del ceppo stesso. Successivamente, tramite un “fluctuation test”, è stato possibile ottenere a partire dallo stesso ceppo, un pool di 14 ceppi resistenti a concentrazioni ancora maggiori dello stesso metallo pesante. Tutti i ceppi isolati e il ceppo parentale sono stati sottoposti a spot test in piastra per valutarne la crescita su terreno minimo addizionato di Mo(VI) 7,5mM; lo screening ha validato la capacità di crescita dei 14 ceppi evoluti a tali concentrazioni di molibdato, contrariamente al ceppo parentale che ha esibito una crescita inferiore. La non ridondanza del pool di ceppi selezionati è stata valutata incrociando i dati di “fingerprinting molecolare” con i dati fenotipici.
La capacità dei ceppi nel produrre GSH è stata osservata in mosto sintetico al termine di un processo di microvinificazione, grazie al quale è stato possibile valutarne anche la fitness fermentativa. La determinazione del GSH, mediante test enzimatici, ha evidenziato una consistente variabilità tra i ceppi nella produzione di GSH con valori, in alcuni casi paragonabili o superiori al parentale, pur con differenze non sempre statisticamente significative.
I risultati ottenuti supportano l’efficacia della strategia impiegata nell’aumentare la diversità genetica all’interno di una popolazione; tale strategia non OGM può essere ampiamente applicata quale metodo high-throughput per la selezione di individui mutanti in grado di esprimere i fenotipi di interesse.
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Abstract
The interest for yeast strains capable of producing high amounts of glutathione (GHS) has recently increased. Particularly in the oenological field GSH has great notoriety, since it is able to control the oxidative damages and to limit the product’s browning, preserving its organoleptic properties and thus reducing the employ of sulfur dioxide.
Various strategies have been exhaustively described in order to obtain yeast strains enhanced in GSH production. Evolution based strategies are actually widely employed in order to reach this goal and also have a good impact on the general consensus, receiving the consumer’s approval, because they do not feature any genetic manipulation technique.
Recently the UMCC research group has developed an evolution based strategy for the selection of GSH-producing yeast strains, which combines steps of sexual recombination and subsequent selection of interesting recombinant strains, through the application of a rapid and highly selective screening technique. The resistance to hexavalent molybdate has been used as a selection character for high GSH producing strains.
By applying this strategy to the oenological yeast strain UMCC 855 (=21T2), a pool of 8 different evolved strains has been obtained, among which the strain UMCC 2851 (=Mo21T2-5) has stood out because of its ability to produce GSH in way higher amounts than its parental strain.
In this research, a strategy based on mitotic recombination techniques has been applied to the strain UMCC 2851; such procedures enable the formation of new potentially interesting alleles, as opposed to those based on sexual recombination, which lead to gene permutations. This strategy has been chosen according to the assumption that our initial strain already possessed the best possible gene combination for GSH production; this means that further sexual recombination would not have led to enhanced phenotype, but rather to a drift towards the average GSH production level of the population.
The strain UMCC 2851 has been initially exposed to selective stress in minimum medium containing Mo(VI) 5mM; a concentration, which limited the strain growth during previous studies. Afterwards, a pool of 14 strains resistant to even higher concentration of toxic metal has been obtained through a “fluctuation test”, starting from the same initial yeast strain. All the obtained evolved strains and the parental strain were then spot-tested on Petri dishes in order to evaluate their growth on minimum media containing Mo(VI) 7,5mM. This screening step has confirmed the ability of the 14 evolved strains to grow at such molybdate concentration, at which the parental strain, on the other hand, showed impaired growth. The non-redundancy of the obtained pool was evaluated by combining the data resulting from molecular fingerprinting techniques and phenotypic characters.
The strain’s GSH production capability has been evaluated on synthetic must at the end of microvinification trials, through which also their fermentative fitness has been examined. The GSH determination was carried out through enzymatic tests and has highlighted a considerable variability in the GSH production levels of the strains. The resulting values were comparable or higher than the parental strain’s even if not always showing statistically significant difference.
All results support the efficiency of the employed strategy in providing genetic diversity among the population. Such non-GMO strategy can be widely applied as a high throughput method for the selection of mutated individuals capable of expressing phenotypes of interest.
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