Riassunto analitico
Le Epidermolisi Bollose Ereditarie (EBE) costituiscono un gruppo eterogeneo di malattie dermatologiche caratterizzate da un’eccessiva fragilità cutanea dovuta a mutazioni in geni codificanti per diverse proteine della giunzione derma-epidermide. Nel 2005 il nostro gruppo ha realizzato il primo trial clinico di fase I/II per la correzione di una forma autosomica recessiva di EB, trapiantando su un paziente lembi di epidermide autologhi geneticamente corretti. Per il trasferimento genico sono stati utilizzati vettori retrovirali MLV-derivati, contenenti il cDNA della catena β3 della laminina5 (LAMB3) sotto il controllo del promotore LTR. Per valutare il follow up a sette anni dal trapianto sono state prelevate due biopsie dalla zona di epidermide geneticamente corretta. L’analisi istologica e di microscopia elettronica non evidenzia alterazioni nel differenziamento e nella struttura della giunzione derma-epidermide, infatti la proteina LAM5 e le sue rispettive catene α3, β3 e γ2, mostrano la stessa espressione e localizzazione di un campione di controllo. ¬L’analisi genomica delle integrazioni retrovirali mediante LM-PCR rileva la presenza di alcuni siti d’integrazione, a dimostrazione che l’epidermide corretta è sostenuta da poche cellule staminali trasdotte. L’insieme di questi dati conferma la stabilità del trattamento, ponendo le basi per possibili nuovi approcci di terapia genica ex vivo.
Tuttavia, l’utilizzo di vettori MLV–derivati ha sollevato alcune perplessità in termini di sicurezza, in seguito a fenomeni di mutagenesi inserzionale riscontrati in trial clinici per patologie del sistema emopoietico. Per migliorare la sicurezza e specificità legata all’utilizzo dei vettori retrovirali, è stata quindi sviluppata una strategia alternativa di trasferimento genico basata su vettori gamma-retrovirali self inattivanti (SIN), nei quali una proteina reporter (eGFP) è sotto il controllo del promotore della cheratina 14 (K14). La produzione stabile di questo vettore è garantita da una nuova linea cellulare “packaging” PG368, derivata dalla PG13, nella quale il vettore di espressione virale è inserito in un locus definito, sfruttando il meccanismo di ricombinazione omologa mediato dalla ricombinasi Flp (RMEC). Il costrutto d’interesse pEMTAR-biK14-eGFP è disegnato in modo tale da inattivare i promotori all’LTR garantendo così una maggiore sicurezza nell’espressione del transgene. Parallelamente alla “packaging” eGFP sono state sviluppate, con il sistema RMEC, tre nuove linee cellulari di “packaging” esprimenti, sotto il controllo del promotore di K14, tre geni associati a due forme di EB giunzionale (LAMB3, COL17) e una distrofica (COL7A1). L’utilizzo del vettore virale esprimente la GFP sta permettendo di valutare l’efficienza di trasduzione in cheratinociti umani, nonché di procedere con studi di fase pre-clinica volti a valutare l’efficacia, la sicurezza e la stabilità.
Questi nuovi vettori retrovirali rappresenteranno un’alternativa efficace e potenzialmente più sicura rispetto ai vettori retrovirali MLV-derivati pazienti per lo sviluppo della terapia genica di pazienti affetti da gravi malattie genetiche della pelle.
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Abstract
Epidermolysis Bullosa (EB) is an inherited blistering skin disorder characterized by dissociation of the dermal-epidermal junction due to mutations in genes encoding several adhesion proteins. In 2005 our group started the first worldwide phase I/II clinical trial for a patient affected by an autosomic recessive form of JEB. For LAMB3 gene delivery we used a MLV-derived retroviral vector carrying the corrected LAMB3 cDNA under the control of the viral LTR.
One and seven years after transplantation of genetically corrected cultured epidermal grafts, two biopsies were taken from the patient’s treated skin. Histological analysis and Electron microscopy didn’t reveal any alteration of the differentiation process nor of the dermal-epidermal junction. Indeed we observed a proper expression and location of LAM5-α3 β3 and γ2 chains comparable to those of healthy controls. The genome-wide analysis of the retroviral integration sites performed by LM-PCR shows some integration sites demonstrating that the epidermal homeostasis of the corrected graft is sustained by a discrete number of transduced stem cell. These data confirm the functional permanent correction of the disease and lead to the development of new gene therapy approaches for EB treatment.
However the use of MLV-derived retroviral vector raised safety concerns due to mutagenesis insertional events occurred in some clinical trials for hematopoietic diseases. To improve the system in term of safety and specificity, we developed an alternative gene transfer strategy based on Self Inactivating Gamma-Retroviral (SIN) vectors, in which eGFP reporter is under the control of the promoter-enhancer elements derived from keratin 14 (K14) gene. To enable production of SIN γ-retroviral vector from stable producer clones we develop a new PG13-based packaging cell, known as PG368. Viral vector expression construct can be inserted in a predefined genomic locus of PG368 packaging cell by an Flp-recombinase-mediated targeted cassette exchanged reaction (RMEC). A new vector-targeting construct pEMTAR-biK14-eGFP is able to inactivate LTR promoter and improves the safety of the transduction system. In addition, we developed by RMEC system three different packaging cell line expressing LAMB3, COL17A1 (Junctional EB forms) and COL7A1 (Distrophic EB), under control of the human K14 promoter. The eGFP reporter allows to assess the keratinocyte transduction efficiency and to develop pre-clinical studies to estimate efficiency, safety and stability of this system.
These vectors would be an effective, and potentially safer alternative to MLV-based retroviral vectors for gene therapy approaches, giving a new chance to treat a greater number of genetic skin disorders.
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