• Cellular model
• CRISPR/Cas9
• EEC
• Gene editing
• TP63

Il sistema CRISPR/Cas, inizialmente identificato come meccanismo immunitario adattivo nei batteri e negli archea, è stato rapidamente riproposto per l’editing del genoma. Rappresenta uno strumento promettente per affrontare le mutazioni autosomiche dominanti interrompendo l'allele mutante attraverso il meccanismo di riparazione del DNA Non-Homologous End Joining (NHEJ), lasciando intatto l'allele wild-type (WT). Sebbene si mostri promettente, molte mutazioni dominanti a singolo nucleotide rimangono difficili da colpire a causa della bassa specificità delle nucleasi Cas, che non sono in grado di discriminare tra alleli mutati e wild-type. Pertanto, lo sviluppo di una nucleasi Cas altamente specifica è essenziale per far avanzare il trattamento delle malattie genetiche dominanti che possono essere prese di mira. Un'altra sfida deriva dalla rarità e ultra-rarità di alcune malattie dominanti, insieme all'accesso limitato alle cellule dei pazienti per la ricerca.
Questa tesi mira a sviluppare un modello cellulare biallelico utilizzando HEK293T per replicare il contesto genomico biallelico delle malattie dominanti, consentendo uno screening rapido e affidabile di nuovi sistemi CRISPR/Cas sia per la loro efficienza di editing che per la loro specificità allelica. Come prova di principio, è stato replicato il contesto biallelico del gene TP63. Le mutazioni che si verificano nel dominio di legame al DNA (DBD) di questo gene sono responsabili della sindrome Ectrodattilia-displasia Ectodermica-palatoschisi (EEC), una malattia autosomica dominante ultra-rara caratterizzata da ectrodattilia, displasia ectodermica e schisi orofacciali.
Per generare il modello cellulare biallelico, sono stati prodotti due vettori lentivirali Self-Inactivating (SIN). La prima cassetta conteneva la sequenza codificante di TP63 WT legata a eGFP, mentre la seconda conteneva la sequenza codificante di TP63 con una SNV legato alla proteina fluorescente PLUM. Le cellule HEK293T sono state successivamente trasdotte con i due vettori lentivirali e diluite serialmente in modo da ottenere un clone con integrazione stabile di una sola copia di ciascuna cassetta. L'idea principale è che, in seguito all'editing di uno o entrambi gli alleli, si possa osservare una riduzione del/i corrispondente/i segnale/i di fluorescenza a causa delle mutazioni frameshift introdotte dagli indel indotti dall'editing. Per verificare che le due cassette potessero essere considerate come due alleli dello stesso locus, nonostante i diversi punti di integrazione, dovevamo essere sicuri che entrambe potessero essere ugualmente modificate. Tre gRNA, mirati alla sequenza codificante di TP63, sono stati selezionati nel modello cellulare biallelico basato su HEK293T. I primi due gRNA (G1 e G2) sono stati progettati per colpire entrambi gli alleli, mentre il terzo (G3) è stato progettato per colpire solo la cassetta che contiene PLUM. L'analisi citofluorimetrica delle cellule trasfettate ha mostrato che l'efficienza di editing dei gRNA G1 e G2 era paragonabile su entrambi gli alleli. D'altra parte, G3 ha indirizzato l’editing solo all'allele che presenta PLUM, come previsto. Le efficienze di editing sono state analizzate anche mediante il sequenziamento di Sanger e l'analisi TIDE, confermando che la riduzione dei segnali di fluorescenza è stata causata dal processo di editing che introduceva indel. Pertanto, questo approccio ci ha permesso di dirigere l'editing su entrambi gli alleli del locus di interesse nonché su uno solo dei due, a seconda del disegno dei gRNA specifici.
In conclusione, questo progetto ha dimostrato che il sistema biallelico basato su HEK293T consente uno screening efficiente e affidabile di vari (e potenzialmente nuovi) sistemi CRISPR/Cas. Infatti, essere in grado di colpire solo un allele in questo sistema con una nucleasi Cas specifica e/o con uno specifico gRNA potrebbe essere il primo passo verso trattamenti efficaci per le mutazioni dominanti.

The CRISPR/Cas system, initially identified as an adaptive immune mechanism in bacteria and archaea, was rapidly repurposed for genome editing. It represents a promising tool for addressing autosomal dominant mutations by disrupting the mutant allele through the Non-Homologous End Joining (NHEJ) DNA repair mechanism, leaving the wild-type (WT) allele untouched. Although it shows promise, many single-nucleotide dominant mutations remain challenging to target due to the low specificity of the Cas nucleases, which are unable to discriminate between mutated and wild-type alleles. Therefore, developing a highly specific Cas nuclease is essential for advancing the treatment of dominant genetic diseases that can be targeted. Another challenge arises from the rarity and ultra-rarity of certain dominant diseases, along with the limited access to patients' cells for research. This thesis aims to develop a biallelic cellular model using HEK293T to replicate the biallelic genomic context of dominant diseases, allowing a fast and reliable screening of new CRISPR/Cas systems both for their editing efficiency and allele-specificity. As a proof of concept, the biallelic context of the TP63 gene was replicated. Mutations occurring in the DNA Binding Domain (DBD) of this gene are responsible for the Ectrodactyly-Ectodermal dysplasia-Cleft (EEC) syndrome, an ultra-rare autosomal dominant disorder characterized by ectrodactyly, ectodermal dysplasia and orofacial clefts. To generate the biallelic cellular model, two Self-Inactivating (SIN) Lentiviral vector were produced. The first cassette contained the coding sequence of WT TP63 linked to eGFP, while the second carried the coding sequence of TP63 with a SNV linked to the PLUM fluorescent protein. HEK293T cells were subsequently transduced with the two Lentiviral vectors and serially diluted in order to obtain a clone with stable integration of only one copy of each cassette. The main idea is that, following the editing of one or both alleles, a reduction in the corresponding fluorescence signal(s) can be observed due to the frameshift mutations introduced by the editing-induced indels. To verify that two cassettes could be consider as two alleles of the same locus, despite the different integration points, we had to be sure that both of them could be equally edited. Three gRNAs, targeting the TP63 coding sequence, were screened in the HEK293T-based biallelic cellular model. The first two gRNAs (G1 and G2) were designed to target both the alleles, while the third one (G3) was designed to only target the Plum-carrying cassette. Cytofluorimetric analysis of the transfected cells showed that the editing efficiency was comparable with both G1 and G2 gRNAs on both alleles. On the other hand, G3 only directed editing to the PLUM-carrying allele, as expected. Editing efficiencies were also analysed by Sanger sequencing and TIDE analysis, confirming that the reduction of the fluorescence signal(s) was caused by the editing process introducing indels. Thus, this approach enabled us to direct the editing on both alleles of the locus of interest as well as on only one of the two, depending on the design of specific gRNAs. In conclusion, this project demonstrated that the HEK293T-based biallelic system enables efficient and reliable screening of various (and potentially novel) CRISPR/Cas systems. Indeed, being able to only target one allele in this system with a specific Cas nuclease and/or with a specific gRNA could be the first step towards effective treatments for dominant mutations.