Riassunto analitico
Attualmente sono in fase di ricerca e sviluppo nanoanticorpi definiti “single variable domain on a heavy chain antibodies” (VHH), i quali possano agire come modulatori allosterici del recettore (FSHR) dell’ormone follicolo-stimolante (FSH). L’obiettivo è quello di ottenere farmaci non-ormonali ad azione contraccettiva. FSHR è un recettore accoppiato a proteina G e, nella donna, è espresso nelle cellule della granulosa ovariche, dove favorisce la crescita e la maturazione del follicolo ovarico. I modulatori allosterici si suddividono in negativi (NAM), positivi (PAM), silenti (SAM) o biased (BAM), a seconda dell’effetto che attuano sulle vie di trasduzione del segnale.
In questo studio ho testato due VHH con l’obiettivo di modulare i segnali mediati da FSH. Ho valutato l’attivazione della cyclic adenosine monophosphate (cAMP)/protein kinase A (PKA)-pathway. In cellule primarie umane della granulosa luteinizzate (hGLC), trattate con dosi crescenti di FSH, in presenza o meno di due VHH (A e B), ho valutato i livelli intracellulari di cAMP e la secrezione di estradiolo. Tali procedure sono state svolte mediante homogeneous time-resolved fluorescence (HTRF), mentre nella linea cellulare KGN ho valutato i livelli intracellulari di cAMP mediante bioluminescence resonance energy transfer (BRET) e la vitalità cellulare mediante saggio colorimetrico del bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT).
Ho dimostrato che VHH A determina una diminuzione dell’accumulo di cAMP FSH-mediato entro tutte le concentrazioni di nanoanticorpo utilizzate, mentre VHH B media lo stesso effetto solo alla concentrazione 100 nM. Entrambi i nanoanticorpi non inducono variazione significativa della sintesi di estradiolo mediata da FSH, né della vitalità cellulare.
In conclusione, i due nanoanticorpi modulano la trasduzione del segnale intracellulare mediata da FSHR. Sia VHH A che B riducono la produzione di cAMP, risultando nell’aumento della concentrazione efficace al 50% (EC50) che il plateau della curva dose-risposta di cAMP. I due VHH non interferiscono sulla sintesi degli ormoni steroidei e sulla vitalità cellulare, suggerendone l’attività allosterica esercitata preferenzialmente sulla produzione di cAMP ma non su eventi più tardivi.
Tali risultati suggeriscono un potenziale uso in vivo dei due VHH, poiché sono in grado di inibire la via di trasduzione associata a proliferazione cellulare, ma non la steroidogenesi ovarica.
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