Riassunto analitico
The aim of this work was to clone, heterologously produce and purify the ApbE protein, a flavin transferase. This protein is important because it is the flavinic donor to a threonine residue of the NosR protein, which in turn is essential for the maintenance of the catalytic activity of N2OR, the only enzyme capable of reducing nitrous oxide. The nitrous oxide reductase (N2OR) is a metalloenzyme involved in the last step of the denitrification pathway and it converts N2O into N2. An incomplete denitrification pathway can lead to an accumulation of reaction intermediates, such as NO and N2O, in the atmosphere, with harmful effects towards the environment. The maintenance of N2OR protein in its active state is important to limit the ecological damage. The apbE gene from Marinobacter hydrocarbonoclasticus was successfully amplified and cloned in a pET-22b vector. The protein heterologusly production in E.coli was optimized (optical density and time of induction) and accessed by SDS-PAGE by following the presence of a band at 36 kDa that corresponds to the expected molecular mass of ApbE. The protein was produced in the soluble fraction and the chromatogram obtained during the purification shows that the protein was eluted at an imidazole concentration of 50 mM. The total volume of the protein at the end of the dialysis process and of the concentration cycles was 4.2 mL and the quantification with the Lowry method showed a concentration of 30.4 mg/mL. From the quantification of the flavinic group the ratio of the absorbance at 450 nm and 278 nm was determined and since the amount of the protein containing the FAD was very small, it was reconstituted with FAD. The procedure was successful since the amount of FAD per protein increased from 0.02 to 0.033.
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Abstract
Lo scopo di questo lavoro è stato di clonare, produrre in maniera eterologa e purificare la proteina ApbE, una flavin transferasi.
Questa proteina è importante in quanto dona flavine a un residuo di treonina presente nella proteina NosR, che a sua volta è essenziale per il mantenimento dell'attività catalitica di N2OR, l'unico enzima in grado di ridurre l'ossido nitroso.
L'ossido nitroso reduttasi (N2OR) è un metallo-enzima coinvolto nell'ultimo step del pathway di denitrificazione e converte N2O in N2. Un pathway di denitrificazione incompleto può portare ad accumulo di intermedi di reazione, come No e N2O, nell'atmosfera, con effetti dannosi nei confronti dell'ambiente.
Il mantenimento della proteina N2OR nel suo stato attivo è importante per limitare i danni ecologici.
Il gene apbE da Marinobacter hydrocarbonoclasticus è stato amplificato e clonato con successo nel vettore pET-22b.
La produzione eterologa della proteina in E.coli è stata ottimizzata (densità ottica e tempo di induzione) e confermata con l'SDS-PAGE che ha mostrato la presenza di una banda a 36 kDa che corrisponde alla massa molecolare prevista di ApbE.
La proteina è stata prodotta nella frazione solubile e il cromatogramma ottenuto durante la purificazione mostra che la proteina è stata eluita a una concentrazione di imidazolo pari a 50 mM.
Il volume totale di proteina al termine del processo di dialisi e dei cicli di concentrazione era di 4.2 mL e la quantificazione proteica, ottenuta con il metodo di Lowry, ha mostrato una concentrazione pari a 30.4 mg/mL.
Dalla quantificazione del gruppo flavinico è stato determinato il rapporto tra l'assorbanza a 450 nm e 278 nm e, dato che la quantità di proteina legante il FAD era molto bassa, questa è stata ricostituita con il FAD. La procedura ha avuto successo dato che il rapporto tra la concentrazione del FAD e della proteina è aumentato da 0.02 a 0.033.
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