Riassunto analitico
Questo progetto di ricerca interessa lo sviluppo di un nuovo liposoma per veicolare gli oligonucleotidi “Polypurine reverse Hoogsteen” (PPRH) nelle cellule di mammifero. I PPRHs sono strutture a forcina formate da due filamenti di polipurine a specchio che corrono in orientazione antiparallela. I nucleotidi non riportano nessun tipo di modificazione. I due filamenti, collegati da un’ansa pentatimidinica, sono legati attraverso legami Hoogsteen inversi intramolecolari. Uno dei filamenti del PPRH può legarsi attraverso legami Watson-Crick al suo bersaglio polipirimidinico corrispondente nel DNA a doppio filamento, provocando il dislocamento della sequenza polipurinica della doppia elica.
In questo lavoro si è deciso di investigare la veicolazione dei PPRHs in seguito a trasfezione in differenti linee cellulari cancerose. In particolare, diversi liposomi cationici, originati da un composto primario comune, sono stati esaminati come vettori non virali e caratterizzati attraverso saggi di binding in gel di agarosio. Il liposoma migliore, che abbiamo chiamato dioleil-RG, è stato in seguito validato usando un PPRH diretto contro il gene antiapoptotico “survivina” dopo trasfezione in diverse linee cellulari cancerose, e contro il gene “DYRK1A” in una linea cellulare di neuroblastoma. Survivina e DYRK1A sono stati scelti come bersagli perché il primo è potenzialmente necessario per la sopravvivenza delle cellule cancerose e la sua inibizione causa un effetto proapoptotico, mentre il secondo è coinvolto della regolazione del ciclo cellulare e nella cancerogenesi, è sovraespresso nell’encefalo dei pazienti con sindrome di Down, e potrebbe avere un ruolo significativo nella neurodegenerazione precoce e nella suscettibilità ai tumori negli individui affetti dalla sindrome citata.
L’internalizzazione in cellule è stata studiata attraverso citometria di flusso in cellule SH-SY5Y di neuroblastoma e in cellule PC3, mentre un monitoraggio in vitro della vitalità cellulare contro il gene della survivina è stato condotto sulle linee cellulari PC3, SH-SY5Y, HeLa, Hep-G2, A549 e MCF-7. Inoltre è stata valutata l’espressione genica a livello di RNA e proteine adoperando un PPRH diretto contro il gene DYRK1A nella linea cellulare di neuroblastoma SH-SY5Y, risultante in una diminuzione di entrambi rispetto al controllo non trattato, dovuto all’effetto del PPRH veicolato attraverso il composto dioleil-RG.
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Abstract
This research involved the development of a new liposome to deliver Polypurine reverse Hoogsteen (PPRH) oligonucleotides into mammalian cells. PPRHs are DNA hairpins formed by two mirror polypurine strands running in an antiparallel orientation. The nucleotides do not bear any kind of modifications. The two strands, linked by a pentathymidine loop, are bound through intramolecular reverse Hoogsteen bonds. One of the strands of the PPRH can bind by Watson-Crick bonds to their corresponding polypyrimidine target in the dsDNA provoking a displacement of the polypurine sequence of the duplex.
In this work, we decided to investigate the delivery of PPRHs upon transfection into different cancer cell lines. In particular, different cationic liposomes starting from a common lead were explored as non-viral vectors and characterized by binding assays in agarose gel. The best liposome, that we called dioleil-RG, was then validated using a PPRH directed against the antiapoptotic gene “survivin” upon transfection into different cancer cell lines, and against the “DYRK1A” gene in a neuroblastoma cell line. Survivin and DIRK1A were selected as targets because the first one is potentially required for cancer cells to remain viable and its inhibition causes a proapoptotic effect, while the second one is implicated in the regulation of cell cycle, survival and tumorigenesis; it is overexpressed in the brain of patients with Down syndrome and it may play a significant role in the early neurodegeneration and cancer susceptibility of individuals with this syndrome.
Internalization was studied through flow-cytometry in SH-SY5Y neuroblastoma cells and PC3 cells, while an in vitro screening of cell viability against the survivin gene was conducted on PC3, SH-SY5Y, HeLa, Hep-G2, A549 and MCF-7 cells. In addition, RNA and protein expression levels were evaluated using a PPRH directed against “DYRK1A” gene in SH-SY5Y neuroblastoma cell line, resulting in a decrease of these related to the untreated control, due to the effect of the PPRH delivered by dioleil-RG.
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