Riassunto analitico
Le interazioni biotiche tra batteri e metazoi sono presenti praticamente in tutti i phyla animali anche se per alcuni taxa sono poco conosciute e studiate. I batteri simbionti influenzano numerosi aspetti della biologia animale. Le comunità microbiche presenti nei tardigradi sono ancora scarsamente indagate; dai pochi studi eseguiti emerge che il phylum Tardigrada ospita probabilmente batteri endosimbionti ospite-specifici, ma anche batteri associati al cibo e batteri provenienti negli habitat colonizzati dai tardigradi.
Lo scopo di questa tesi è stato: i. identificare il tasso di infezione di batteri simbionti appartenenti all’ordine Rickettsiales e Holosporales in tre specie di tardigradi (Echiniscus trisetosus; Richtersius coronifer e Macrobiotus macrocalix) mediante un approccio molecolare; ii. individuare l’organo/gli organi dei tardigradi che ospitano i batteri simbionti tramite ibridazione fluorescente in situ; iii. sviluppare un protocollo di ibridazione in situ da applicare a nuclei e cromosomi di tardigrado (Hypsibius dujardini) per indagare l’eventuale presenza di geni batterici nel genoma dell’ospite.
Da questo lavoro di tesi è emerso che la percentuale di infezione da parte di Rickettsiales e Holosporales è piuttosto bassa in tutte e tre le specie indagate di tardigrado. Utilizzando come riferimento studi simili eseguiti su altri organismi. è stato messo a punto un protocollo di ibridazione fluorescente in situ da applicare a tardigradi in toto. La sua applicazione ha consentito di stabilire che in E. trisetosus, i batteri simbionti si collocano nella gonade femminile, l’ovario; in R. coronifer invece, anche se le immagini ottenute risultano meno chiare e precise, essi sembrano essere localizzati nel lume del tubo digerente, probabilmente intercalati tra i microvilli intestinali. L’analisi cariologica condotta su uova di H. dujardini a diverso tempo di sviluppo embrionale ha evidenziato che le uova deposte da 24 ore presentano il maggior numero di piastre metafasiche, risultando quindi le più idonee all’applicazione del protocollo di ibridazione in situ fluorescente per ricercare geni batterici nel genoma dei tardigradi. L’indagine cariologica ha inoltre consentito di confermare il numero cromosomico di H. dujardini (2n = 10). Per lo sviluppo del protocollo di ibridazione in situ su cromosomi sono state innanzitutto costruite, tramite clonaggio, due sonde da utilizzare come controlli positivi ed è stato applicato il protocollo per verificare che le piastre presenti su vetrino non venissero danneggiate o perse a causa dei numerosi trattamenti a cui sono sottoposti per l’ibridazione in situ. La prima prova, che non ha previsto l’uso delle sonde, ha mostrato cromosomi e nuclei ben definiti, confermando la applicabilità del protocollo. La seconda prova, che ha visto l’utilizzo delle due sonde, non ha mostrato la fluorescenza attesa, ma i risultati preliminari permetteranno di perfezionare la metodologia al fine di identificare l’eventuale trasmissione orizzontale di geni dai batteri ai tardigradi.
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