• enzyme
• hydrolase
• PET
• post consumer
• SM14

Gli enzimi hanno numerose potenziali applicazioni per il biorisanamento di ambienti contaminati e vengono sempre più utilizzati come strumento rispettoso dell'ambiente con grande efficienza.
Questa tesi si basa sulla caratterizzazione della PETasi SM14 appartenente alla classe delle serina idrolasi. La reazione idrolitica avviene su substrati PET e produce acido tereftalico (TPA), bis(idrossietil)tereftalato (BHET), mono(idrossietil)tereftalato (MHET) e glicole etilenico (EG) che possono essere rilevati e quantificati tramite RP-HPLC.
L'enzima viene prodotto in cellule di E. coli BL21 e purificato con cromatografia IMAC utilizzando una colonna His-Trap. La proteina purificata è stata quindi impiegata per preparare il saggio funzionale.
Le reazioni sono state eseguite su piccola scala in provette contenenti 1 μM di proteine ​​in presenza di plastica post-consumo. Inizialmente abbiamo studiato la dipendenza dal pH dell’enzima per produrre le condizioni ottimali di degradazione. Quindi, abbiamo studiato la tolleranza al sale della PETasi SM14 quando NaCl è stato aggiunto all'ambiente di reazione.
L’azione della PETasi è stata studiata mediante la quantificazione dei prodotti derivati ​​dalla degradazione del polimero mediante HPLC e mediante l’osservazione della superficie del substrato con SEM (microscopia elettronica a scansione) e AFM (microscopia a forza atomica).

Enzymes have numerous potential applications for bioremediation of contaminated environments, and they are increasingly being used as an environmentally friendly tool with great efficiency. This thesis is based on the characterization of PETase SM14 belonging to the class of serine hydrolases. The hydrolytic reaction occurs on PET substrates and produces terephthalic acid (TPA), bis(hydroxyethyl)terephthalate (BHET), mono(hydroxyethyl)terephthalate (MHET) and ethylene glycol (EG) that can be detected and quantified via RP-HPLC. The enzyme is produced in E. coli BL21 cells and purified with IMAC chromatography using a His-Trap column. The purified protein was then employed to prepare the functional assay. The reactions were performed in small scale in tubes containing 1 μM of protein in presence of post-consumer plastic. Initially we investigated the enzyme’s pH dependency in order to produce the optimal conditions of breakdown. Then, we studied the salt-tolerance of the PETase SM14 when NaCl was added to the reaction environment. The action of PETase was investigated by the quantification of the products derived from the polymer degradation by HPLC and thought the observation of the substrate’s surface with SEM (Scanning Electron Microscopy) and AFM (Atomic Force Microscopy).