Riassunto analitico
Alzheimer’s disease (AD) is nowadays the most common cause of senile dementia. The initial symptoms such as loss of short-term memory are, over time, accompanied by spatial disorientation, changes in behavior and loss of long-term memory. Cognitive impairment and progressive neuronal loss are two characteristics of this neurodegenerative pathology, that are flanked by astrogliosis and microglial activation. The two neuropathological hallmarks of AD are extracellular amyloid plaques, made of amyloid β peptides (Aβ), and intracellular neurofibrillary tangles, composed of hyperphosphorylated Tau protein. By now, three genetic loci (presenilin1, 2 and amyloid precursor protein, APP) have been associated with familial forms of AD and within them several mutations have been discovered. Many mouse models have been generated over the years to get further insight on AD pathogenesis and to screen drugs and therapies. 5XFAD is a quite new model that carries five Familial Alzheimer’s Disease (FAD) mutations, two in the presenilin gene and three in the APP gene. The onset of AD hallmarks and characteristic in this mouse model has not yet been fully elucidated. Moreover, the correlation between plaque formation and cognitive impairment has not been investigated yet. Considering the lack of information concerning this model of AD, the aim of this thesis is to relate cognitive deficits with brain neuropathology. This has been fulfilled performing several behavioral tests focused on hippocampus-dependent deficits and histological examinations such as immunofluorescence, thioflavin-S and congo red staining, in heterozygous 5XFAD using wild type animals with the same genetic background as control. Both types of analysis have been performed on 2 and 7 month-old animals whereas mice with the age of 5 and 6 months have been submitted only to behavioral tests. Thioflavin-S staining, similar to congo red staining, brought to light that the plaque formation begins at 2 months and concerns few areas such as cortex and subiculum; at 7 months, plaques were widely spread in all brain areas. Immunofluorescence revealed an intense astrogliosis and activated microglia especially near plaques. At 2 months, Aβ is mainly intracellular whereas at 7 months Aβ can be principally found extracellularly. This correlates with amyloid plaque formation. This analysis also revealed sex-related differences. In fact, in males the process of plaques formation seems to be slower, the number and the size of plaques at 7 months is smaller and the quantity of intracellular Aβ is higher compared to females. On the contrary behavioral tests, except for Morris water maze, have not revealed statistically significant deficits at any age but just tendencies. The main differences between heterozygous 5XFAD and wild type mice have been found in the Morris water maze learning curve, where transgenic mice learn more slowly. All data suggest that 5XFAD mice are indeed a very precocious model as concerns plaque formation but the development of amyloid plaques seems to be not directly correlated to cognitive deficits. This lack of dependency of cognitive impairment from plaque deposition points to the importance of soluble forms of Aβ rather than aggregated ones and opens up several new research perspectives.
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Abstract
La malattia di Alzheimer è ai giorni nostri la causa più comune di demenza senile. I sintomi iniziali come la perdita di memoria a breve termine sono, con il passare del tempo, accompagnati da disorientamento spaziale, cambiamenti nel comportamento e perdita di memoria a lungo termine. Deficit cognitivi e perdita neuronale progressiva sono due caratteristiche di questa patologia neurodegenerativa, queste sono affiancate da astrogliosi e attivazione microgliale. I due tratti tipici della malattia di Alzheimer sono placche amiloidi extracellulari, costituite da β amiloide (Aβ), e tangles neuro fibrillari, composte dalla proteina Tau iperfosforilata. Fino ad ora sono state trovate molte mutazioni in 3 loci genetici (presenilina 1, 2 e proteina precursore dell’amiloide, APP) associati a forme familiari di Alzheimer. Nel corso degli anni sono stati generati diversi modelli animali per comprendere meglio la patogenesi della malattia di Alzheimer e per testare farmaci e terapie. Il modello 5XFAD è abbastanza recente, porta 5 mutazioni trovate in forme familiari di Alzheimer (FAD), due nel gene della presenilina e tre nel gene di APP. Lo sviluppo dei segni distintivi e delle caratteristiche tipiche della patologia, in questo modello animale, non è ancora stato totalmente chiarito. Inoltre non è stata ancora studiata la correlazione tra la formazione delle placche e il danno cognitivo. Vista la mancanza di informazioni su questo modello di Alzheimer, lo scopo di questa tesi è correlare la neuropatologia con i deficit cognitivi. Questo è stato ottenuto eseguendo diversi test comportamentali incentrati su deficit ippocampo-dipendenti e esami istologici, quali immunofluorescenza e le colorazioni tioflavina-S e congo red, su animali 5XFAD eterozigoti usando animali wild type con lo stesso background genetico come controllo. Su animali di 2 e 7 mesi sono state eseguite entrambe le tipologie di analisi mentre animali di 5 e 6 mesi sono stati sottoposti solo a test comportamentali. La colorazione tioflavina-S, come il congo red, hanno evidenziato l’inizio della formazione delle placche intorno ai 2 mesi ristretto in poche aree cerebrali come la corteccia e il subiculum. A 7 mesi le placche sono diffuse in tutte le aree cerebrali. L’immunofluorescenza ha rivelato un’intensa astrogliosi e microglia attivata specialmente nei pressi delle placche. A 2 mesi, Aβ è principalmente intracellulare mentre a 7 mesi può essere ritrovato per lo più extracellulare. Questo correla con la formazione delle placche di amiloide. Tale analisi ha anche evidenziato differenze tra animali di sesso diverso. Infatti, nei maschi il processo di formazione delle placche sembra più lento, il numero e le dimensioni delle placche a 7 mesi sono minori e la quantità di amiloide intracellulare è maggiore rispetto alle femmine. Al contrario i test comportamentali non hanno rivelato, a nessuna età, deficit statisticamente significativi ma solo tendenze ad eccezione del Morris water maze. La differenza principale tra 5XFAD eterozigoti e wild type è stata trovata nella curva di apprendimento del Morris water maze dove i topi transgenici imparano più lentamente. Tutti i dati suggeriscono che i 5XFAD siano un modello precoce per quanto riguarda lo sviluppo delle placche ma la loro formazione non sembra essere direttamente correlata ai deficit cognitivi. Questa mancanza di dipendenza dei deficit dalla deposizione delle placche sottolinea l’importanza delle forme solubili di Aβ piuttosto che le forme aggregate e apre diverse prospettive di ricerca.
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