Riassunto analitico
Le interazioni tra proteine sono essenziali per il funzionamento di tutti i processi cellulari. La stabilità termodinamica di un complesso proteina-proteina non è una semplice somma dei contributi individuali dei residui che interagiscono. I residui che fanno parte di regioni altamente impaccate e connesse alle interfacce (definite "regioni calde") e che contribuiscono in modo predominante all'energia libera di legame di un complesso proteina-proteina o proteina-acido nucleico sono definiti come hotspots, ossia residui la cui sostituzione con alanina porta a una significativa diminuzione (ΔΔG ≥ 2 kcal/mol) dell'energia libera di legame. L'identificazione degli hotspots è cruciale per inferire i determinanti delle malattie e per la scoperta di farmaci di precisione. Tuttavia, fino ad oggi, solo un numero limitato di interfacce è stato sottoposto a screening in vitro per la ricerca di hotspots, a causa dell'elevato costo di questo approccio. D'altra parte, le previsioni in silico degli hotspots nelle interazioni molecolari sono altamente sfidanti.
Il gruppo di ricerca della mia tesi di laurea magistrale è coinvolto da tempo nello sviluppo e nell'applicazione di un approccio all'avanguardia chiamato analisi delle reti strutturali proteiche (PSN) per predire la comunicazione strutturale nei sistemi biologici. Il metodo si basa sull'applicazione della teoria dei grafi alle strutture proteiche. Un'estensione recente dell'analisi PSN riguarda un metodo computazionale per la previsione degli hotspots nelle interazioni proteina-proteina e proteina-acido nucleico. Questo metodo è stato utilizzato per predire i probabili hotspots nel legame GPCR-G protein, effettuando uno screening in silico di tutti i complessi strutturali finora archiviati nella Protein Data Bank (PDB). I recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) sono guardiani critici della trasduzione del segnale negli eucarioti e rappresentano la più grande superfamiglia proteica nel proteoma umano, con oltre 800 membri. Le vie di segnalazione mediate dai GPCR sono state collegate a numerose malattie umane e si stima che i GPCR siano i bersagli del 30-40% di tutti i farmaci attualmente sul mercato. Legandosi alle proteine G, i GPCR agiscono come fattori di scambio di nucleotidi guanina specializzati (GEF), catalizzando lo scambio di GDP legato con GTP.
La distribuzione e il numero di hotspots alle interfacce, che dipende dalle architetture dei complessi, hanno differenziato le famiglie/classi all'interno della superfamiglia dei GPCR. L'analisi ha anche evidenziato hotspots in grado di differenziare le proteine G in base alla segnalazione. Mettere insieme il puzzle di tutti gli hotspots individuati dall'analisi ha permesso di ottenere nuove intuizioni sul processo di accoppiamento recettore-proteina G, con importanti implicazioni in medicina molecolare e scoperta di farmaci.
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Abstract
Protein interactions are essential to the functioning of all cellular processes. The thermodynamic stability of a protein-protein complex is not a simple summation of the individual contributions of the interacting residues. Residues that are part of highly packed and networked regions at the interfaces (hot regions) and that contribute dominantly to the binding free energy of a protein-protein or protein-nucleic acid complex are defined as hotspots, i.e. a residue whose replacement by alanine leads to a significant (ΔΔG ≥ 2 kcal/mol) drop in the binding free energy. The identification of hotspots is crucial to inferring the determinants of diseases and for precision drug discovery. However, to date only a limited number of interfaces have been in vitro screened for residue hotspots, that approach being very expensive. On the other hand, in silico predictions of hotspots in molecular recognition is highly challenging.
The hosting group of my Master’s Thesis is involved since long in developing and applying a cutting edge approach called protein structure network (PSN) analysis to predict the structural communication in biological systems. The method is based on the application of the graph theory to protein structures. A recent extension of protein structure network (PSN) analysis concerns a computational method for predicting the hotspots of protein-protein and protein-nucleic acid interaction. The method has been used here to predict likely hotspots of GPCR-G protein binding, by in silico screening all structural complexes stored so far in the Protein Data Bank (PDB).
G protein coupled receptors (GPCRs) are critical eukaryotic signal transduction gatekeepers and represent the largest protein superfamily in the human proteome, with more than 800 members. GPCR-mediated signaling pathways have been linked to numerous human diseases, and GPCRs are the targets of an estimated 30–40% of all drugs currently on the market. By binding to G proteins, GPCRs act as specialized guanine nucleotide exchange factors (GEFs) catalyzing the exchange of bound GDP to GTP.
The distribution and number of hotspots at the interfaces, which depends on the architectures of the complexes, differentiated the families/Classes within the GPCR superfamily. The analysis highlighted also hotspots able to differentiate G proteins according to signaling. Putting together the puzzle of all the hotspots inferred from the analysis allowed to gain insights into the process of receptor-G protein coupling with important implications in molecular medicine and drug discovery.
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