Riassunto analitico
La retinite pigmentosa (RP) è un gruppo eterogeneo di rare malattie neurodegenerative caratterizzate dalla degenerazione dei fotorecettori. Inizialmente la degenerazione consiste nella perdita dei bastoncelli, seguita dalla perdita dei coni nelle fasi più avanzate. Le mutazioni genetiche in diversi geni legati alla malattia causano un aumento del Ca2+ intracellulare nei fotorecettori, che, attraverso una cascata di segnalazione molecolare dipendente dalle calpaine, porta alla morte dei fotorecettori. Tra i diversi approcci neuroprotettivi riportati per limitare la progressione della RP, il PEDF, in particolare la sua regione neurotrofica minima mutata 17mer[H105A], media la sopravvivenza dei fotorecettori promuovendo l'estrusione del Ca2+ tramite le pompe PMCA. L'espressione sostenuta di 17mer[H105A] mediante iniezioni intravitreali del cDNA ,trasportato da un vettore virale AAV2, nel modello murino knock-in RP RhoP23H/+ ha comportato una riduzione della morte cellulare fino a 6 mesi dopo il trattamento. Tuttavia, la terapia genica con AAV innesca una risposta immunitaria nell'occhio e impedisce trattamenti ripetuti o trattamenti con AAV2, volti a fornire altri fattori. Pertanto, le particelle PEG10 simil-virali (VLPs) rappresentano una strategia alternativa per il trasferimento in vivo di mRNA terapeutici di fattori neurotrofici. Infatti le VLPs infettano le cellule bersaglio grazie alla loro composizione in proteine simili a quelle virali, ma non contengono materiale genetico virale. Nello specifico, l'obiettivo di questa tesi consiste nel creare VLPs come sistema in grado di trasportare mRNA cargo alle cellule bersaglio retiniche, come le 661W-A11. Con questo obiettivo, abbiamo pianificato di testare il sistema consegnando mRNA codificante per la EGFP, che è facilmente tracciabile. Abbiamo quindi generato il plasmide cargo pTriex_5'-UTR(Peg10)-EGFP-3'-UTR(Peg10) mediante tre strategie di clonaggio consecutive, in cui il cDNA di EGFP è stato fiancheggiato dalle UTRs di Peg10, in quanto sono sequenze che possono essere legate dalla proteina PEG10 legante l'RNA. Successivamente, le cellule Gesicle 293T sono state transientemente trasfettate con tre plasmidi: pCMV_VSV-G, pCMV_PEG10 e pTriex_5'-UTR(Peg10)-EGFP-3'-UTR(Peg10) per produrre le VLPs. In questo modo, le VLPs saranno composte da un involucro formato dalla glicoproteina VSV-g e un capside ed un nucleocapside codificati dal gene gag di PEG10. In particolare, la strategia mirava ad arricchire le VLPs con l'mRNA specifico del EGFP tramite il legame tra la proteina nucleocapside di PEG10 e l'mRNA contenente il 5'-UTR(Peg10) e il 3'-UTR(Peg10) e quindi a consegnare l'mRNA di EGFP alle 661W-A11, ovvero cellule bersaglio dei fotorecettori a bastoncello.
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Abstract
Retinitis pigmentosa (RP) is a heterogeneous group of rare neurodegenerative diseases characterized by initial degeneration of rod photoreceptors, followed by the loss of cone photoreceptors in more advanced stages. Genetic mutations in different genes linked to the disease cause an increase of intracellular Ca2+ in photoreceptors, which, through a calpain-dependent molecular signaling cascade, leads to photoreceptors death. Among the different neuroprotective approaches reported to restrain progression of RP, PEDF, particularly its mutated minimal neurotrophic region 17mer[H105A], mediates photoreceptor survival by promoting the extrusion of Ca2+ via PMCA pumps. Sustained expression of 17mer[H105A] by intravitreal injections of the cDNA delivered by an AAV2 viral vector in the RhoP23H/+ knock-in RP murine model resulted in reduced cells death up to 6 months after treatment. However, AAV gene therapy triggers an immune response in the eye and precludes repeated treatments or treatments with AAV2 aimed at delivering other factors. Therefore, PEG10 viral-like particles (VLPs) represent an alternative strategy for the in vivo transfer of therapeutic mRNAs of neurotrophic factors, as they can infect target cells due to their composition of viral-like proteins, yet they lack viral genetic material. Specifically, the aim of this thesis was to create a VLP delivery system, that could deliver cargo mRNA into retinal target cells, such as 661W-A11. With this aim, we planned to test the system by delivering mRNA encoding EGFP that can be easily traced. We, thus, generated the pTriex_5’-UTR(Peg10)-EGFP-3’-UTR(Peg10) cargo plasmid by three consecutive cloning approaches, in which EGFP cDNA was flanked by the Peg10 UTRs, sequences that can be bound by the PEG10 RNA-binding protein. Subsequently, Gesicle 293T cells were transiently transfected with three plasmids: pCMV_VSV-G, pCMV_PEG10 and pTriex_5’UTR(Peg10)-EGFP-3’UTR(Peg10) to produce VLPs. In this way, the VLPs will be composed of an envelope formed by the VSV-g glycoprotein and a capsid and nucleocapsid encoded by the PEG10 gag gene. Specifically, the strategy aimed at enriching the VLPs with the specific EGFP mRNA by the binding of the nucleocapsid PEG10 protein to the mRNA containing the 5’UTR(Peg10) and the 3’UTR(Peg10) and thus deliver EGFP mRNA to 661W-A11, rod photoreceptor target cells.
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