Riassunto analitico
Il ferro è un minerale essenziale per la vita ma la sua reattività chimica, se non finemente regolata, è alla base della patogenesi di numerose malattie. La principale proteina coinvolta nella regolazione del metabolismo del ferro è l’epcidina che bloccando l’assorbimento del ferro dalla dieta e il rilascio del metallo ottenuto dall’emolisi degli eritrociti senescenti riduce il ferro circolante. La regolazione dell’espressione del gene codificante l’epcidina HAMP è mediata principalmente da Bone Morphogenetic Protein/Small Mother Against Decapentaplegic (BMP/SMAD) signaling su cui agiscono i maggiori stimoli regolatori. Classicamente, l’inizio del signaling in vescicole rivestite di clatrina è associato all’attivazione di SMAD pathway, mentre, in caveolae alle vie SMAD-indipendenti come MAPK/ERK, p38, PI3K. Recenti evidenze hanno però dimostrato che CAV1 (componente essenziale delle caveolae) può essere coinvolta anche nell’attivazione della via SMAD-dipendente e nella regolazione del gene HAMP. D’altro canto, la nota associazione del signaling caveola-dipendente con l’attivazione del MAPK/ERK pathway e la dimostrazione di una correlazione tra l’attività del complesso pERK1/2 e l’espressione del gene HAMP ha reso necessario indagare una possibile interazione tra le vie MAPK/ERK e BMP/SMAD nella regolazione di HAMP.
Metodi: Le cellule della linea epatica Hep3B non trasfettate o trasfettate con RNAi specifici per i geni delle proteine SMAD1 e SMAD5, sono state trattate sia singolarmente che in associazione con l’inibitore della fosforilazione di ERK1-2 (U0126), con l’inibitore specifico dell’attività chinasica dei recettori delle BMP deputata alla fosforilazione/attivazione del complesso pSMAD1/5/8 (LDN-193189) ed infine con BMP6. Studi di espressione sono stati condotti mediante tecniche di Western blot e qRT-PCR.
Risultati: Il trattamento con U0126 incrementa la fosforilazione del complesso pSMAD1/5 che però riduce l’espressione del tipico gene target ID1 (inibitore della proteina legante il DNA), ma aumenta l’espressione di HAMP. La capacità dei recettori delle BMP di fosforilare il complesso R-SMAD è stata bloccata mediante il pretrattamento con LDN, in questo contesto sperimentale, il trattamento con U0126 perde la capacità di incrementare pSMAD1/5 e di modulare l’espressione dei geni ID1 e HAMP indicando che l’attività dei recettori BMP è essenziale per l’effetto indotto dall'inibizione di pERK1/2. Il trattamento BMP6-U0126, invece, non comporta l’alterazione di pSMAD1/5 rispetto al trattamento con solo BMP6 ma tende a potenziare l’effetto del BMP6 sull’espressione del gene HAMP, probabilmente, rendendo attivo il complesso pSMAD1/5 preferenzialmente verso il gene HAMP piuttosto che verso il gene target ID1. Quindi, si è voluto analizzare il contributo di SMAD1 e SMAD5 nella regolazione di HAMP. Le cellule silenziate per i geni delle proteine SMAD1 e SMAD5 sono state trattate con U0126 e/o BMP6. In assenza di SMAD5, sia in condizioni fisiologiche che sotto stimolo BMP6, il trattamento con U0126 non aumenta pSMAD1/5 né l’espressione di HAMP, come accade invece in assenza di SMAD1. Quindi, un complesso pSMAD1/5 composto prevalentemente da SMAD5 è alla base dell’effetto dell’inibizione di pERK1/2. pERK1/2, probabilmente, determina il sequestro di SMAD5 nel citoplasma impedendogli di essere fosforilato dai recettori delle BMP e riducendone il contributo nel complesso pSMAD attivo, che, così, non è in grado di indurre selettivamente HAMP.
Conclusioni: Nel presente studio si dimostra l’esistenza di un cross-talk tra le vie di trasduzione del segnale MAPK/ERK e BMP/SMAD nella regolazione dell’espressione dell’epcidina attraverso la modulazione del contributo di SMAD5 nel complesso trascrizionalmente attivo pSMAD1/5.
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