Riassunto analitico
La distrofia muscolare facioscapolo-omerale (FSHD) è la terza miopatia ereditaria più comune con le caratteristiche di una malattia genetica complessa. La FSHD è caratterizzata da debolezza muscolare asimmetrica dei muscoli facciali, delle spalle, addominali e del cingolo pelvico. Al giorno d'oggi non esiste un trattamento specifico per la FSHD. Il locus genetico della malattia è stato mappato sul cromosoma 4 ed è stato associato a riarrangiamenti che si verificano in una sequenza ripetuta in tandem (D4Z4) situata nella regione subtelomerica del braccio lungo del cromosoma 4, nella posizione 4q35. FSHD Region Gene 1 (FRG1) è stato il primo gene ad essere identificato in prossimità dell'array D4Z4. È importante sottolineare che, tra i molteplici geni candidati alla FSHD, la sovraespressione selettiva di FRG1 nel muscolo scheletrico provoca la distrofia muscolare. I muscoli di topi che sovraesprimono FRG1, nel periodo pre-distrofico, mostrano un fenotipo immaturo con alterazione del metabolismo e potenziamento delle pathway di Ampk, p38Mapk e p53. Lo scopo della mia tesi è la caratterizzazione del fenotipo distrofico dei muscoli che sovraesprimono FRG1 nelle fasi avanzate della malattia e la ricerca della signature molecolare indotta da FRG1 nei pazienti con FSHD attraverso l'analisi di biopsie muscolari. Precedenti studi indicano che nei topi che sovraesprimono FRG1 l'attivazione cronica della via di p53 porta ad una condizione di senescenza, confermata dall'espressione di citochine coinvolte nel fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP). Abbiamo ipotizzato che nei muscoli FRG1 la presenza prolungata di mediatori di SASP potrebbe causare infiammazione cronica e danno muscolare. Infatti, l'analisi istologica del muscolo FRG1 mostra la presenza di cellule mononucleate nei siti perimisiali, proliferazione del tessuto connettivo e un notevole infiltrato cellulare. Dall'analisi di citochine, chemochine e marker di infiammazione, abbiamo identificato nei muscoli FRG1 l'attivazione della risposta immunitaria Th2 in associazione con l'attivazione dei macrofagi M2. Inoltre, attraverso l'analisi molecolare di marcatori specifici e la citofluorimetria a flusso, abbiamo confermato la presenza di progenitori fibro-adipogenici (FAPs), la cui attivazione è promossa dalla presenza dei macrofagi M2. Dalla meta-analisi dei profili di espressione del muscolo transgenico FRG1, di modelli animali e di pazienti affetti da diversi tipi di distrofie muscolari abbiamo trovato una significativa sovrapposizione, suggerendo un possibile meccanismo comune per le varie miopatie. Per questo motivo, abbiamo verificato la presenza della signature molecolare identificata nel nostro modello murino in biopsie di pazienti con FSHD. Abbiamo scoperto che i soggetti affetti mostrano un fenotipo muscolare immaturo, come i topi FRG1. Abbiamo anche osservato l'attivazione della via di p53 con la comparsa di SASP e confermato la presenza del processo infiammatorio con coinvolgimento di macrofagi e progenitori fibro-adipogenici (FAPs). Questi risultati hanno importanti implicazioni per i soggetti portatori di FSHD e aprono a nuove prospettive traslazionali per quanto riguarda potenziali biomarcatori e strategie terapeutiche.
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Abstract
Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) is the third most common hereditary myopathy with feature of a complex genetic disease. FSHD is characterized by asymmetric muscle weakness of facial, shoulder, abdominal and pelvic girdle muscles. Nowadays there is no specific treatment for FSHD. The disease genetic locus has been mapped to chromosome 4 and has been associated with rearrangements occurring in a tandemly repeated sequence (D4Z4) located in the subtelomeric region of the long arm of chromosome 4, at 4q35. FSHD Region Gene 1 (FRG1) was the first one to be identified in proximity of the D4Z4 array. Importantly, among the multiple FSHD candidate genes, the selective overexpression of FRG1 in skeletal muscle causes muscular dystrophy. Muscles from FRG1 overexpressing mice, in pre-dystrophic period, display an immature phenotype with alteration of metabolism and enhancement of Ampk, p38Mapk and p53 signaling. The aim of my thesis is the characterization of the dystrophic phenotype of FRG1 overexpressing muscles in the advanced phases of the disease and the search for FRG1 induced molecular signature in FSHD patients through molecular analysis of muscle biopsies. Previous studies indicate that in FRG1 overexpressing mice the chronic activation of the p53 pathway leads to a condition of senescence, shown by the expression of typical cytokines involved in senescence-associated secretory phenotype (SASP). We hypothesized that in FRG1 muscles the prolonged presence of SASP mediators might cause chronic inflammation and muscle damage. In fact, the histological analysis of FRG1 muscle shows the presence of mononuclear cells at perimysial sites, proliferation of connective tissue and a considerable cellular infiltrate. From the analysis of cytokines, chemokines and markers of inflammation, we identified the activation of the Th2 immune response in association with M2 macrophage activation in FRG1 muscles. Beside, trough molecular analysis of specific markers and flow cytofluorimetry, we confirmed the presence of fibro-adipogenic progenitors (FAPs), whose activation is promoted by the persistence of M2 macrophages. From the meta-analysis of expression profile of FRG1 transgenic muscle, animal models and patients affected by different kind of muscular dystrophies we found a significant overlap, suggesting a possible common mechanism for various disease. For this reason, we have verified the presence of the molecular signature identified in our mouse model in biopsies of FSHD patients. We found that affected subjects display an immature phenotype, as FRG1 mice. We also observed the activation of the p53 pathway with the appearance of SASP and confirmed the presence of inflammatory process with the involvement of macrophages and fibro-adipogenic progenitors (FAPs). These results have important implication for subjects carrying FSHD and open to new translational perspective regarding potential biomarkers and therapeutic strategies.
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