Riassunto analitico
Le cellule neoplastiche vanno incontro a numerose alterazioni molecolari, che portano all’acquisizione di un fenotipo tumorale. In questo lavoro di tesi, descriviamo un sistema che modula la via di segnale Akt-dipendente indotta dalla glicoproteina di secrezione Clusterina (sCLU), la cui overespressione è molto frequente nel carcinoma prostatico. Recentemente, è stata inoltre dimostrata la funzione di sCLU come attivatore della serina/treonina chinasi Akt. Basandoci su questa osservazione, utilizzando come modello le cellule epiteliali prostatiche umane PNT1A, abbiamo voluto verificare se sCLU attiva la via di segnale PI3K/Akt. I risultati ottenuti dall’analisi in RPPA (Reverse Phase Protein Array) hanno mostrato in cellule PNT1A stabilmente trasfettate con Clusterina (CLU) una elevata fosforilazione delle proteine più importanti del pathway di PI3K/Akt rispetto al loro controllo (MOCK). Inoltre, le fosfatasi PHLPP1 e PHLPP2 (PH domain Leucine-rich repeat Protein Phosphatase), responsabili della defosforilazione di Akt su serina 473, sono risultate particolarmente downregolate nelle cellule CLU. Pertanto abbiamo valutato se sCLU è in grado di alterare la stabilità di queste fosfatasi e/o di modificarne l’espressione attraverso un maccanismo epigenetico. I risultati mostrano che il calo delle fosfatasi PHLPP1/2 indotta da sCLU è in parte recuperato da inibitori del proteasoma e da inibitori delle chinasi GSK3 e CK1, e quindi che sCLU stimola la degradazione attraverso la fosforilazione e successiva ubiquitinazione di PHLPP1/2 descritta in letteratura per altri modelli. Abbiamo poi dimostrato per la prima volta che sCLU altera anche la traduzione degli mRNA di PHLPP 1/2 tramite il regolatore negativo miR-190.
Siccome il ruolo della Clusterina nella migrazione e invasione cellulare è tuttora controverso, in quanto è in grado sia di inibire sia di stimolare il comportamento metastatico delle cellule tumorali, abbiamo analizzato gli effetti della sua overespressione nella migrazione di cellule PNT1A (non invasive), e di cellule tumorali LNCaP e PC3 (invasive). I saggi di migrazione hanno mostrato che l’overespressione della Clusterina aumenta il potenziale migratorio delle PNT1A ad un livello paragonabile a quello delle LNCaP e PC3. Per confermare che la sCLU ha un effetto pro-migratorio, i saggi di migrazione sono stati ripetuti su cellule PNT1A wild-type, LNCaP e PC3 utilizzando il conditioned medium di cellule CLU, ricco di sCLU, come chemoattraente, portando a risultati analoghi. Per contro, e come atteso, il suo silenziamento porta invece ad una diminuzione dell’attività migratoria. Poiché la overespressione di sCLU modifica il profilo di fosforilazione di Akt, in particolare aumentando la fosforilazione della isoforma Akt2, e a causa del diverso/opposto ruolo attribuito alle isoforme di Akt (Akt1 e Akt2) nella migrazione cellulare a seconda del modello analizzato, abbiamo studiato l’effetto del silenziamento delle singole isoforme di Akt sulla migrazione cellulare. I risultati stabiliscono in modo chiaro che, mentre il knockdown di Akt1 non altera significativamente il potenziale migratorio delle cellule CLU, il silenziamento di Akt2 lo abolisce completamente. In conclusione, questo lavoro ha dimostrato per la prima volta che la Clusterina secreta è in grado di modificare il fenotipo di cellule prostatiche normali da cellule con basso potenziale migratorio a cellule con alto potenziale migratorio, attraverso la modulazione delle fosfatasi PHLPP1 e PHLPP2 e, di conseguenza, dell’attività di Akt.
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Abstract
Cancer cells undergo a variety of molecular alterations that lead to the acquisition of a cancer phenotype. Here, we describe a regulatory system that modulates the PI3K/Akt pathway downstream of the 75-kDa glycoprotein secreted Clusterin (sCLU), in prostate normal and cancer cells. The overexpression of sCLU is very frequent in prostate cancer. Recently sCLU was reported to possess Akt-activating activity. This prompted us to investigate how its overexpression influences PI3K/Akt signaling in a study model represented by human epithelial prostate PNT1A cells stably transfected with sCLU or with empty vector alone (from here on called CLU and MOCK respectively). By the use of Reverse Phase Protein Array (RPPA) technology we found that CLU cells showed a marked increase in phosphorylation of several members of the PI3K/Akt cascade, included Akt itself, and in particular the Akt isoform 2. We found that the phosphatases PHLPP1 and PHLPP2 (PH domain Leucine-rich repeat Protein Phosphatase), known to dephosphorylate Akt at S473, were severely downregulated in CLU cells with respect to MOCK cells. We thus investigated whether sCLU alters PHLPPs protein stability or acts through an epigenetic mechanism. We found that sCLU indeed stimulates PHLPPs degradation by β-TrCP, upon its sequential phosphorylation by Casein Kinase 1 (CK1) and Glycogen Synthase Kinase 3 β (GSK3β). Interestingly, we further demonstrated that sCLU alters also the translation of PHLPPs in CLU cells through the negative regulator miR-190, thus accounting for the drop of PHLPPs content in CLU cells. Next, because of the still controversial functions of sCLU, which has been reported to inhibit or to stimulate the metastatic behavior of cancer cells depending on the cell model, we investigated the effects of Clusterin overexpression on cell migration in PNT1A cells, which are not expected to display an invasive phenotype, and in the prostate cancer epithelial cell lines LNCaP and PC3. The result was extremely clear: not only CLU overexpression gave PNT1A cells the same migratory behavior of wild-type LNCaP and PC3 cells, but increased the migration index of all the above cell models by two to four times, compared to the expression of empty vector alone. Conversely, in the same model silencing of Clusterin abrogated CLU cell migration. The effect of sCLU was further validated by filling the lower chamber of the transwell insert of MOCK cells with conditioned medium from CLU cell cultures, as chemoattractant. Noteworthy, this was sufficient to increase the migration index of MOCK cells to that of CLU cells. Due to the well known different role of Akt isoforms in cell migration, and in the light of the diverse phosphorylation profile of Akt1 versus Akt2 observed both by RPPA and Western blotting in CLU versus MOCK cells, the effect of single-isoform silencing on cell migration was explored. While silencing Akt1 affected migration only slightly, silencing Akt2 prevented migration of CLU cells completely. The same result was obtained by pharmacological inhibition of Akt2. We concluded that Clusterin enhances migration of PNT1A cells through activation of Akt2. Accordingly, we hypothesized that sCLU might drive migration also of prostate cancer cells with an invasive phenotype. In confirmation, the migration of LNCaP and PC3 cells exposed to conditioned medium from CLU cells was indeed dramatically increased. All together, our results demonstrate for the first time that Clusterin can switch the low migration phenotype of normal prostate cells towards a high migration phenotype through the modulation of the expression of the PHLPPs and, in turn, the activity of Akt.
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