Riassunto analitico
Il carcinoma ovarico è all'ottavo posto tra i principali tumori e la quinta causa di morte per cancro nelle donne. I segni ed i sintomi del carcinoma ovarico sono spesso assenti nelle fasi iniziali; così, nella stragrande maggioranza dei casi il carcinoma ovarico viene diagnosticato in una fase avanzata, e la terapia per questa patologia è molto complessa. La proteomica ha dato indicazioni utili sulle perturbazioni delle vie di segnalazione all'interno delle cellule tumorali, permettendo di trovare nuovi bersagli per l'azione dei farmaci e possibili bio-marcatori come indicatori predittivi riguardo la terapia da adottare. Il mio lavoro di tesi utilizza l'approccio proteomico della spettrometria LC-MS/MS, e in particolare il metodo MRM mirato (targeted Multiple reaction monitoring) con lo scopo di individuare e quantificare un profilo di risposta al trattamento chemioterapico con pemetrexed su campioni di linee cellulari di carcinoma ovarico e di tessuti umani, prima e dopo il trattamento con pemetrexed. Per raggiungere questo obiettivo ho proceduto: a. alla ottimizzazione dei parametri cromatografici e di spettrometria di massa su una miscela di 116 peptidi proteotipici di sintesi rappresentativi di 25 proteine valutate potenzialmente interessanti; b. alla selezione di biopsie di tessuto di pazienti affette da carcinoma ovarico, raccolte prima e dopo il trattamento con il farmaco, da cui sono state estratte le proteine totali; c. alla digestione degli estratti proteici con tripsina e analisi dei digeriti triptici tramite nanoLC-ESI MS/MS per propositi quantitativi e qualitativi; d. all'ottenimento di dati semi-quantitativi mediante western blot per gli stessi campioni cellulari e di tessuto, su 5 delle proteine selezionate: TS, ATIC, HSP90, DHFR e TRAP1. I risultati del lavoro svolto hanno condotto a: 1. identificazione qualitativa delle proteine d'interesse nei campioni cellulari e di tessuto; 2. validazione dalla copresenza fino a 4 peptidi proteotipici per ogni proteina mediante sensibili e specifici esperimenti MRM; 3. osservazione di una significativa differenza dei livelli di espressione su 5 proteine analizzate tramite western blot, emersa da biopsie di pazienti con diversa risposta alla terapia con pemetrexed.
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Abstract
Ovarian cancer (OC) is the eighth most common cancer and the fifth leading cause of cancer death in women. Signs and symptoms of ovarian cancer are frequently absent in early stages; thus, the vast majority of ovarian cancers is diagnosed at an advanced stage, and therapy for this pathology is very complex.
Proteomics has given useful insight into the perturbations of signaling pathways within tumor cells, allowing one to find new targets for drug action and possible bio- markers of the efficacy of a given therapy.
My thesis work takes advantage of the LC-MS / MS spectrometry proteomics approach, and in particular the targeted MRM method (Multiple Reaction Monitoring), to detect and quantify a possible profile of response to chemotherapy with pemetrexed on samples of ovarian cancer cell lines and selected human tissues, before and after treatment with this drug.
To achieve this objective I proceeded: a. to optimize chromatographic and mass spectrometry parameters on a mixture of 116 proteotypic peptides of synthesis, representative of 25 potentially interesting proteins; b. to chose tissue biopsies of patients with ovarian cancer that had a different response to therapy with pemetrexed, from which total proteins were collected; c. to digest with trypsin the proteins, previously extracted from the selected samples and to analyze tryptic digests by nanoLC-ESI MS / MS for quantitative and qualitative purposes; d. to obtain, by western blot assay, semi-quantitative data on 5 of the selected proteins on the same cell and tissue samples: TS, ATIC, HSP90, DHFR and TRAP.
The results of my work led to: 1. a qualitative identification of individual proteins in cell and tissue samples; 2. the validation of the copresence up to 4 proteotypic peptides for each protein, through specific and sensitive MRM experiments; 3. the observation of significant differences in the expression levels on 5 proteins analyzed by western blot, emerged from the tissue samples of patients with different response to therapy with pemetrexed.
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