Riassunto analitico
I microRNA (miRNAs) sono piccoli RNA endogeni non codificanti, a singolo filamento, in grado di regolare negativamente, a livello post-trascrizionale, l’espressione di circa il 30% dei geni codificanti proteine. I miRNA svolgono anche un ruolo cruciale in numerosi processi biologici, tra cui lo sviluppo e la patogenesi di alcune malattie, come il cancro.
Le famiglie miRNA-10 e miRNA-196, definite ‘Hox-miRNAs’, sono codificate da sequenze contenute all’interno dei clusters dei geni Hox. Diversi esperimenti dimostrano il loro ruolo nel regolare preferenzialmente gli mRNA dei geni Hox, legandosi alle loro regioni 3’ UTR.
Studi precedentemente condotti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che la trascrizione del gene codificante per il miR-196b è positivamente regolata da CDX2 e alcune proteine HOX posteriori. Entrambi questi gruppi di proteine regolano lo sviluppo dell’asse antero-posteriore (A-P) e il loro pattern di espressione stabilisce l’identità dei diversi segmenti corporei. Inoltre, CDX2 è coinvolto nella morfogenesi dell’intestino e conferisce identità ai diversi segmenti del tratto gastrointestinale adulto.
Al fine di identificare i predetti geni target del miR-196b, è stata svolta un’analisi bioinformatica. L’attenzione si è focalizzata sul fattore di trascrizione GATA6, il quale è espresso nel compartimento proliferativo dell’epitelio intestinale umano, e ha un pattern di espressione opposto rispetto a quello di CDX2. Innanzitutto, sono stati analizzati i profili di espressione del miR-196b, di GATA6 e di CDX2 mediante esperimenti di real time PCR e western blot in linee cellulari umane di cancro del colon. Successivamente, il precursore del miR-196b è stato co-trasfettato con un costrutto reporter contenente la regione 3’ UTR di GATA6, in linee cellulari di cancro del colon, osservando una diminuzione dei livelli di attività del gene reporter. Inoltre, cellule di adenocarcinoma e carcinoma di colon sono state trasfettate con il solo microRNA, confermando il suo ruolo nell’inibire i livelli endogeni di GATA6.
È stata utilizzata anche la linea cellulare Caco-2, come modello di differenziamento intestinale in vitro. In questo contesto, è stato dimostrato che i livelli di miR-196b e di CDX2 aumentano con il progredire del differenziamento, mentre l’espressione di GATA6 risulta essere diminuita solo a livello proteico. Ciò suggerisce che il miR-196b possa avere un ruolo nella regolazione post-trascrizionale di GATA6 anche durante il differenziamento.
È stata altresì effettuata un’analisi quantitativa dell’espressione del miR-196b in pazienti affetti da cancro colorettale (CRC), dimostrando che i livelli del microRNA sono significativamente deregolati nei campioni tumorali, rispetto ai controlli sani. In particolare, il miR-196b risulta essere notevolmente upregolato in pazienti affetti da tumori scarsamente differenziati, mentre risulta essere preferenzialmente downregolato in pazienti con metastasi linfonodale.
Questi dati suggeriscono, dunque, che il miR-196b possa essere coinvolto nella riduzione dei livelli di GATA6 osservata a livello post-trascrizionale nell’epitelio del colon umano. Inoltre, gli alterati livelli del miR-196b osservati in campioni umani di CRC suggeriscono un suo possibile ruolo come marcatore di malattia.
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Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are endogenous, non coding, single-stranded RNAs (ssRNAs) of 19-25 nucleotides in length that are generated from hairpin-shaped structures and involved in post-transcriptional inhibition of protein-coding genes. MicroRNAs are predicted to control over 30% of all protein-coding genes, and they are implicated in almost all the crucial biological processes, including development and diseases, such as cancer.
miRNA-10 and miRNA-196 are also known as ‘Hox-miRNA’ families, since they are encoded by sequences located within the Hox genes clusters and are experimentally proven to target preferentially Hox mRNAs, by base pairing to their 3’ UTRs.
Previous studies performed in our laboratory demonstrated that miR-196b gene transcription is positively regulated by CDX2 and posterior HOX proteins. Both HOX and CDX2 proteins confer the correct anterior-posterior (A-P) axial coordinates to vertebrate developing embryos, specifying regional identities to body segments. In addition, CDX2 is important in the early processes of intestinal morphogenesis, as well as in the establishment of the identity of the adult gastrointestinal tract.
A bioinformatics analysis was performed in order to identify putative miR-196b target genes. Among several predicted targets, we focused our attention on the transcription factor GATA6, which is expressed in the proliferative compartment of the human intestine, with an expression pattern nearly complementary to that of CDX2. I have initially analyzed the expression profiles of miR-196b, GATA6 and CDX2 by real time PCR and western blot analyses in human colon cancer cell lines. Subsequently, a reporter construct carrying the GATA6 3’ UTR was co-transfected with a miR-196b precursor in colon cancer cell lines, observing an inhibition of the reporter gene activity. In addition, colon carcinoma and adenocarcinoma cell lines were transfected with only the microRNA, confirming that it is able to negatively regulate the endogenous levels of GATA6.
The Caco-2 cell line represents a valuable model of in vitro intestinal differentiation. miR-196b and CDX2 levels were found to increase progressively during differentiation, while GATA6 expression was reduced only at the protein level, supporting the role of miR-196b in post-transcriptional regulation of GATA6 during differentiation as well.
In addition, I performed a quantitative analysis of mature miR-196b expression in patients affected by colorectal cancer (CRC). I observed that miR-196b levels are significantly deregulated in tumour samples, compared to healthy controls. More specifically, a pronounced upregulation of miR-196b was shown in patients with poorly differentiated tumors, whereas a downregulation was displayed by patients with lymph-node metastasis.
Taken together, these data suggest that the mature miR-196b may be involved in the post-transcriptional dampening of GATA6 expression in human colonic epithelium. Moreover, miR-196b was found to be deregulated in human CRC samples, laying the basis for its potential use as a disease marker.
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