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Le cellule tumorali sviluppano spesso meccanismi adattativi per sopravvivere in un ambiente in cui ossigeno e nutrienti scarseggiano. Infatti, queste cellule sono in grado di modificare o riprogrammare il metabolismo cellulare, in modo da sostenere la crescita e la divisione cellulare.
Mitocondri efficienti sono fondamentali per la sopravvivenza delle cellule tumorali. Lon è una proteasi mitocondriale ATP-dipendente, codificata nel nucleo, espressa in tutte le cellule e i tessuti. Lon degrada proteine danneggiate e ossidate e assiste il folding di diverse proteine mitocondriali. Essendo un regolatore delle funzioni mitocondriali, l’espressione di Lon è indotta da diverse fonti di stress, tra i quali ipossia e stress ossidativo. Molteplici evidenze suggeriscono che l’upregolazione di Lon può essere critica per la sopravvivenza delle cellule neoplastiche in presenza di tali stress.
Perciò, gli scopi di questo lavoro sono i) analizzare i livelli di Lon in linee cellulari di tumori di diversa origine, ii) caratterizzare gli effetti della downregolazione di Lon sulla funzionalità mitocondriale e sulla bioenergetica nel modello cellulare cancro colorettale RKO, nel quale Lon è stata silenziata in modo condizionale mediante RNAi e iii) analizzare I livelli di Lon nei campioni di tessuto di cancro colorettale.
Il mRNA di Lon è espresso ad alti livelli in molte linee cellulari tumorali, incluse le MCF7 (carcinoma della mammella) e RKO, rispetto a cellule non trasformate. In linea con i dati sul mRNA, i livelli della proteina Lon aumentano nelle linee cellulari tumorali. In tali cellule, Lon può essere down-regolata condizionalmente con 72 ore di trattamento con doxyciclina. Il silenziamento di Lon causa un leggero aumento delle cellule in apoptosi precoce e un aumento più pronunciato dell’apoptosi tardiva e della necrosi, mediate dal rilascio di cyt c dai mitocondri e l’attivazione della via intrinseca.
Il silenziamento di Lon causa una riduzione nell’espressione di alcuni complessi (I, II, IV) della catena di trasporto degli elettroni, una riduzione dei livelli di ATP e forte diminuzione della respirazione mitocondriale. Considerando tali alterazioni, ci siamo domandati se Lon abbia un ruolo nel determinare cambiamenti nel metabolismo glucidico. Abbiamo analizzato l’espressione di geni critici di questa via metabolica. GLUT1 e G6PDH risultano essere down-regolati nelle cellule RKO silenziate, mentre una diminuzione significativa di G6PDH e LDHA è visibile nelle cellule MCF7 silenziate, comparate ai controlli. I livelli di espressione proteica confermano tali risultati.
In seguito abbiamo analizzato l’espressione di Lon in mezzi di coltura dalla diversa composizione (da un mezzo con glucosio privo di glutammina ad uno contenente anche questo amminoacido), in cui le cellule possono sfruttare vie metaboliche differenti. Le cellule sono state raccolte dopo 1, 4 e 16 ore dal cambio dei mezzi. I livelli di Lon aumentano in cellule raccolte dopo 1 e 4 ore, mentre si stabilizzano nelle cellule raccolte dopo 16 ore, in confronto a cellule lasciate nel mezzo iniziale.
Infine, visto che Lon risulta upregolata nelle cellule RKO, ci siamo domandati se Lon sia upregolata anche in cellule ex-vivo di cancro colorettale (CRC). I livelli di Lon sono circa 4 volte più alti in cellule CRC rispetto alla mucosa normale. Analisi di immunoistochimica confermano una maggiore espressione di Lon nelle cellule CRC rispetto alla mucosa normale.
In conclusione, i nostri dati indicano chiaramente il ruolo centrale di Lon nel mantenere la funzionalità mitocondriale nelle cellule RKO, e un’evidente upregolazione di questa proteina nei tumori; il fatto che la down-regolazione di Lon, o la sua inibizione, possano causare la morte di cellule tumorali del colon potrebbe aprire la strada per nuove strategie di controllo dei tumori, attraverso l’identificazione di molecole che inibiscano l’attività di Lon.

Cancer cells often develop adaptive mechanisms to survive in a microenvironment where oxygen and nutrients are scarce. Indeed, cancer cells have the capability to modify or reprogram cellular metabolism, in order to fuel cell growth and division, and recent evidences indicate the importance of hypoxia and lack of nutrient (in particular glucose) in cell proliferation. Cancer cells require functional mitochondria to survive. Lon protease (Lon) is a nuclear-encoded, mitochondrial ATP-dependent protease ubiquitously expressed in human cells and tissues. Lon degrades oxidized and damaged proteins and participates in the assembly and folding of regulatory proteins. As a regulator of mitochondrial functions, Lon is induced by several stressors, such as hypoxia and oxidative stress. Growing evidences suggest that Lon up-regulation could be critical for cancer cell survival in the presence of these stressing conditions. Accordingly, the aims of this work were i) to analyze Lon levels in cancer cell lines of different origins, ii) to characterize the effects of Lon down-regulation on mitochondrial functions and cellular energetics in a RKO colon cancer cell model, in which Lon was conditionally silenced by RNA interference and iii) to analyze Lon levels in tissue samples from colorectal cancer. Lon mRNA was expressed at high levels in several cancer cells, including MCF7 (breast carcinoma), and RKO (colon carcinoma), if compared with normal, resting PBMCs. Consistent with mRNA data, Lon protein levels were increased in cell lines from solid tumors. We selected RKO and MCF7 as cell models to further analyze the role of Lon in cancer cells; in these cells, we set Lon can be conditionally down-regulated by 72 hours of treatment with doxycycline. Lon silencing caused a slight increase of early apoptotic cells, and a more pronounced increase of late apoptosis and necrosis, mediated by release of cyt c from mitochondria and activation of intrinsic pathway. Lon silencing caused a reduction of the expression of electron transport chain complexes (complex I, complex II, and complex IV being severely affected) and a reduction of ATP levels. Moreover, Lon silencing caused a marked decrease in mitochondrial respiration, and abolished both basal and FCCP-stimulated oxygen consumption. Considering changes seen in ATP synthesis and mitochondrial respiration, we wondered if Lon levels have a role in determining changes in the glucose metabolism pathway. We analyzed the expression of genes crucial for glucose metabolism. GLUT1 and G6PDH resulted down-regulated in RKO silenced cells; a significant decrease of G6PDH and LDHA can be also observed in MCF7 silenced cells, compared to controls. These results have been confirmed at the protein level. We further analyzed the expression levels of Lon in different types of medium (i.e. medium with low glucose and no glutamine, followed by medium with low glucose and glutamine) and, therefore, different metabolic pathways. Cells were harvested after 1, 4 and 16 hours after medium switch. Lon levels increased in cells harvested 1 and 4 hours after medium switch, whereas they stabilized in 16 hour-harvested cells, compared to cells left in the initial medium. Finally, considering that Lon is up-regulated in RKO cancer cells, we asked if Lon could be also up-regulated in Colon-Rectal Cancer (CRC) ex-vivo cells from patients. Levels of Lon were about 4 fold higher in CRC with respect to normal mucosa. Immunochemistry images confirmed a higher expression of Lon in CRC than in normal mucosa. In conclusion, our data clearly indicate a central role of Lon for maintaining mitochondrial functionality in RKO cancer cells, and an evident up-regulation of this protein in tumours; the fact that the down-regulation of Lon, or even its inhibition, might cause the death of colon cancer cells can pave new ways for controlling tumors, likely through the identification of molecules or strategies able to inhibit Lon activity.