Riassunto analitico
Il cancro del colon (CRC) rappresenta la terza causa di morte per tumore nei paesi occidentali. È una neoplasia che colpisce una porzione del tratto intestinale ed è causata da una eccessiva proliferazione delle cellule che rivestono la mucosa del colon. Si tratta di un processo “multi-step”, i cui stadi morfologici sono caratterizzati dall'accumulo successivo di mutazioni a carico di proto-oncogeni e geni onco-soppressori che regolano la proliferazione, il differenziamento e l’apoptosi. Mutazioni a carico di geni appartenenti alla via di segnalazione di Wnt/β-catenina rappresentano l'evento iniziale della trasformazione tumorale nelle cellule epiteliali del colon; per tale motivo questa via di trasduzione del segnale riveste un ruolo fondamentale nello sviluppo della neoplasia. Il suo principale fattore trascrizionale è β-catenina, la cui traslocazione nucleare attiva la trascrizione di numerosi geni che favoriscono la proliferazione cellulare. Per questa ragione, mutazioni che ne causano l’attivazione costitutiva, promuovono lo sviluppo tumorale. Recenti studi condotti nel nostro laboratorio hanno dimostrato l’importanza di una proteina poco studiata, denominata μ-protocaderina, che appartiene alla superfamiglia delle caderine e promuove l’adesione omofilica tra enterociti. Studi di espressione di tale caderina condotti sia in linee cellulari che in casi di CRC, hanno dimostrato che i livelli del suo trascritto sono “down”-regolati rispetto a quelli della mucosa normale del colon. Esperimenti di immunoistochimica hanno inoltre evidenziato la perdita dell’espressione di μ-protocaderina e la corrispondente localizzazione nucleare di β-catenina nel 71% dei pazienti affetti da tumore. L’obiettivo della tesi è quello di caratterizzare la correlazione molecolare tra la via di segnalazione di β-catenina e l’espressione di μ-protocaderina. A tale scopo abbiamo eseguito esperimenti in vitro utilizzando sia linee cellulari di CRC, che colture primarie di enterociti umani, dette organoidi colonici. Dapprima abbiamo trattato le linee HCT116 e CaCo2 con un composto a basso peso molecolare, chiamato FH535, che blocca la traslocazione nucleare di β-catenina e reprime la trascrizione genica mediata dal complesso β-catenina/TCFs. Abbiamo valutato gli effetti del composto mediante QRT-PCR e Western Blot dimostrando che, a seguito del trattamento, MUCDHL risulta iper-espressa, suggerendo una correlazione inversa tra quest'ultima e la via si segnalazione di β-catenina. Per confermare tale risultato, abbiamo silenziato nelle stesse linee cellulari l’espressione del gene TCF4 mediante siRNA. I risultati ottenuti mostrano un incremento dell’espressione di MUCDHL anche in questo set sperimentale, confermando la correlazione inversa tra tale proteina e lo stato di attivazione della via di trasduzione in esame. Per indagare ulteriormente tale relazione abbiamo condotto numerosi esperimenti sugli organoidi colonici, riproducendo in coltura diversi gradi di attivazione della via di trasduzione di Wnt mediante l'utilizzo di miscele di citochine e di un composto attivatore della stessa, il Litio Cloruro. Quindi mediante QRT-PCR abbiamo valutato l’espressione differenziale di MUCDHL e di numerosi geni bersaglio diretti e indiretti della via di segnalazione. Anche in questo modello abbiamo confermato che la diminuzione dell'attività trascrizionale di β-catenina determina l’aumento dell’espressione del gene MUCDHL, mentre si verifica una diminuzione dei livelli di espressione del medesimo gene quando la via di segnalazione di Wnt è trascrizionalmente attiva. I risultati ottenuti da questi esperimenti ci hanno permesso di dimostrare che MUCDHL è un gene a valle della via di segnalazione di β-catenina e che i suoi livelli di espressione sono inversamente proporzionali all'attivazione della stessa; tuttavia saranno necessari ulteriori studi per chiarire il meccanismo molecolare alla base di questa correlazione
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