Riassunto analitico
Lo scopo di questo studio mira ad esplorare la diversità inter e intra-individuale della popolazione fungina in 8 soggetti sani. I funghi coltivabili sono stati isolati in tre tempi di campionamento (0, 3, 12 mesi). La quantità rilevata varia da 1.4 * 102 a 4.5 * 105 cfu/g di feci, solo 5 campioni su 24 presentano una carica al di sotto del limite di detection (<102). La caratterizzazione tassonomica degli isolati è stata condotta mediante RAPD-PCR e sequenziamento delle regioni ITS. Fra gli isolati sono state identificate complessivamente 18 differenti specie appartenenti a 11 generi. La maggior parte dei biotipi appartiene al genere Candida (9), e in particolare a C. albicans (2) e C. zeylanoides (3), e Galactomyces (7). Gli stessi biotipi di C. albicans, C. parapsilosis, C. rugose/pararugosa, R. muchillaginosa, e Issatchienkia terricola sono stati individuati in ospiti diversi, suggerendo che la tecnologia della RAPD-PCR non sia la più adeguata nel tipizzare gli isolati ottenuti a livelli di ceppo. Pertanto, al fine di discriminare i diversi ceppi si è deciso di indagare ulteriormente gli isolati di C. albicans in quanto i più rilevanti nelle interazioni con l’ospite. Per tale indagine sono state utilizzate le tecniche di SSCP e MLP che si basano sull’analisi del polimorfismo mostrato dai microsatelliti ripetuti nel genoma di queste specie. Mediante l’impiego di queste tecniche di fingerprinting sono stati individuati 9 diversi ceppi di C. albicans, rivelando che soggetti diversi presentano ceppi differenti. E’ stata inoltre eseguita l’analisi metagenomica di tutti i campioni, sottoponendoli al sequenziamento della regione ITS dei geni ribosomiali per l’individuazione dell’intera popolazione fungina e del 16S per la componente batterica mediante la tecnica di Next Generation Sequencing, 454-pyrosequencing. Le sequenze grezze e pulite ottenute dal sequenziamento sono state analizzate mediante il software Qiime. In tal modo sono state ottenute un totale di 155 distinte OTU per una media di 32 a campione. La maggior parte delle OTU appartiene al phylum Ascomycota, seguito dal phylum Basidiomycota. E’ stato infine eseguito un confronto tra la popolazione batterica e quella fungina al fine di ipotizzare una correlazione fra le due componenti in termini di colonizzazione intestinale. Nessun metodo singolarmente riesce a rappresentare completamente la diversità fungina dei campioni, e in molti casi le tecniche coltura dipendenti e l’approccio metagenomico forniscono risultati complementari. E’ possibile concludere che molte specie sembrano essere colonizzatori transienti, mentre altre permanenti del tratto intestinale.
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