Riassunto analitico
La mielofibrosi primaria (PMF) è la forma più aggressiva tra le neoplasie mieloproliferative croniche Philadelphia-negative ed attualmente non esistono terapie curative per questo grave disordine ematologico. La peculiarità di questa patologia è l’alterazione dell’architettura del midollo osseo, con iperplasia e displasia dei megacariociti, un aumento della deposizione di fibre di reticolina e collagene che porta ad una progressiva fibrosi midollare, osteosclerosi e neoangiogenesi. Nonostante la PMF sia stata riconosciuta come entità clinica più di 60 anni fa, solo nel 2005 è stata identificata la mutazione JAK2V617F, presente in circa il 50-60% dei pazienti. Da allora sono state identificate molte altre mutazioni nei pazienti con PMF, sebbene meno frequenti rispetto alla mutazione di JAK2. Negli ultimi anni sono stati scoperti nuovi meccanismi patogenetici, tra i quali l’espressione aberrante dei microRNA (miRNA) sembra avere un ruolo molto importante. Allo scopo di approfondire il ruolo della deregolazione dei miRNA nella PMF, in questo progetto di tesi ho eseguito un’analisi integrata tra i profili di espressione dei geni codificanti e dei miRNA ottenuti da cellule CD34+ di pazienti con PMF e CD34+ di donatori sani. L’analisi integrata è stata eseguita in silico mediante il software Ingenuity Pathway Analysis (IPA), che è in grado di predire i targets dei miRNA ed integrare i profili di espressione miRNA-mRNA, al fine di individuare le coppie miRNA-target con un andamento anticorrelato. Da quest’analisi sono emersi numerosi targets con un’espressione anticorrelata rispetto ai relativi miRNA targeting, il che ha permesso di disegnare numerosi networks di interazione potenzialmente coinvolti nella patogenesi della PMF. Tra i vari networks di interazione predetti, ha attirato la nostra attenzione in particolare quello che coinvolge miR-494, poiché questo microRNA, che è up-regolato nella PMF, ha come targets numerosi mRNA, la cui down-regolazione è già stata descritta come associata a neoplasie mieloidi. Per approfondire il ruolo di questo miRNA e valutarne un possibile coinvolgimento nella patogenesi delle PMF, abbiamo overespresso miR-494 in cellule CD34+ normali, purificate da cordone ombelicale, attraverso la nucleofezione di un RNA double-strand capace di mimare l'azione del miRNA endogeno. I dati ottenuti hanno mostrato che l’overespressione di miR-494 in cellule CD34+ normali provoca un accumulo di cellule in fase G0-G1, e forza il differenziamento emopoietico verso il lineage megacariocitario, coerentemente con quanto si osserva nella PMF, dove si verifica un aumento significativo della megacariocitopoiesi. In conclusione, questo lavoro ha permesso di identificare numerose interazioni miRNA-mRNA potenzialmente implicate nella patogenesi della PMF. In particolare, lo studio funzionale di miR-494 attraverso la sua overespressione in cellule CD34+ normali ha mostrato che questo microRNA, upregolato nelle cellule di PMF, è in grado di riprodurre in vitro una megacariocitopoiesi alterata, mimando un importante aspetto della patologia.
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Abstract
Primary Myelofibrosis (PMF) is the most aggressive form of Philadelphia-negative chronic myeloproliferative neoplasms. It is characterized by progressive substitution of the hematopoietic tissue with a fibrous scar in the bone marrow (BM), BM neoangiogenesis, hematopoietic progenitor mobilization in peripheral blood, leukoerythroblastosis, myeloid metaplasia leading to splenomegaly and myeloproliferation, both involving granulocytic and megakaryocytic (MK) lineage. Specifically, hyperplastic MKs are dense clustered together in the BM, showing also dysplastic features, as they present aberrant nuclear/cytoplasmic ratio and hyperchromatic, bulbous, or irregularly folded nuclei.
Although PMF is a clinical entity which is recognized from more than sixty years, only in 2005 was identified the mutation JAK2V617F, present in 50-60% of PMF patients. Since then, many other mutated genes in PMF patients were found. Recently, several new molecular pathogenetic mechanisms were found out. Among them, aberrant microRNA (miRNA) expression especially seems to add up to the molecular complexity of PMF, as specific miRNA signatures capable of discriminating PMF cells from those of normal donors were previously reported.
In order to have a comprehensive picture of miRNA deregulation and its relationship with differential gene expression in primary myelofibrosis we performed an in silico integrative analysis (IA) with Ingenuity Pathway analysis software, which combines the computational predicted targets with the gene expression data, in order to construct regulatory networks of the functional human miRNA-target interactions. IA between DEG and DEM disclosed a high number of predicted targets with anti-correlated expression to the trend of their targeting miRNAs.
Among the interaction network highlighted by IPA, upregulated miR-494 drew our attention, since it targets several down-regulated mRNAs, whose lower expression has been described to play an important role in different myeloid neoplasms. We decided to overexpress this miRNA by nucleofecting its corresponding mimic (dsRNA which mimics mature endogenous miRNAs after transfection into cells) into normal CD34+ cells derived from cord blood, separated by an immunomagnetic method. Assessment of cell cycle variations was performed with Propidium Iodide staining, which pointed out an increase in G0/G1 phase cells. We found that overexpression of miR-494 in CD34+ cells was able to enforce the hematopoietic differentiation towards the MK lineage, which is consistent with the distinctive feature of PMF of an abnormally increased MK population.
In conclusion, this work allowed us to identify a number of miRNA-mRNA interactions potentially involved in the pathogenesis of PMF. In particular, functional studies on miR-494, by means of its overexpression in normal CD34+ cells, showed that this microRNA, up-regulated in PMF cells, is able to reproduce in vitro an altered megakaryocytopoiesis, an important feature of the pathology.
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