Riassunto analitico
Il DNA mitocondriale (mtDNA) è una piccola molecola di DNA circolare a doppio filamento, della lunghezza di circa 16.5 Kb, presente in multipla copia nei mitocondri di tutte le cellule degli eucarioti, inclusi gli esseri umani. Quando si trova al di fuori del mitocondrio, nel citoplasma o negli spazi extracellulari, l’mtDNA può essere riconosciuto come molecola “estranea” da parte di recettori presenti nelle cellule dell’immunità innata: il Toll-like receptor (TLR)-9, presente nelle vescicole endosomiali, il recettore dell’inflammasoma NLRP3, e la proteina cGAS presente nel citoplasma della cellula. Tutte e tre le vie contribuiscono, in maniera diversa, a indurre la produzione di citochine proinfiammatorie. In seguito a danno cellulare, l’mtDNA viene rilasciato nel torrente circolatorio; la sua quantità cresce con l’età e l’aumento appare correlato con il fenomeno dell’”inflammaging”, uno stato infiammatorio cronico, subclinico e di basso grado, presente nei soggetti anziani. A partire da queste premesse, lo scopo di questa tesi è quindi di valutare gli effetti dell’mtDNA circolante sull’attivazione del TLR9 e delle principali pathway infiammatorie sui monociti di soggetti anziani, e di verificare se e in che misura tale risposta risulta alterata se confrontata con quella dei monociti di soggetti giovani. Abbiamo reclutato un totale di 22 soggetti di diversa età (10 giovani di età compresa tra i 24 e 30 anni, 10 anziani di età compresa tra i 70 e 76 anni, e due soggetti di età superiore ai 94 anni). Abbiamo inizialmente confermato che la quantità di mtDNA presente in circolo negli anziani è superiore a quello presente nei giovani, e che la quantità osservata negli anziani è in grado di attivare i monociti isolati in coltura, ma solo dopo pretrattamento con LPS. Abbiamo successivamente concentrato la nostra attenzione sull’attivazione della via mediata da TLR-9, che risponde all’mtDNA endocitato. Indagini di microscopia confocale hanno evidenziato che i monociti esprimono il TLR-9, in vescicole intracellulari, in maniera simile ad altri tipi cellulari. Il livello di espressione non appare significativamente modificato con l’età. Quando i monociti sono trattati con LPS + mtDNA, quest’ultimo viene endocitato e colocalizza con il TLR-9, suggerendo che l’mtDNA venga effettivamente riconosciuto dal TLR-9. L’analisi del contenuto di mtDNA intracellulare dopo separazione delle frazioni mitocondriale e citoplasmatica mostra che in seguito a stimolazione con LPS, il contenuto di mtDNA aumenta di circa 2,2 volte rispetto al controllo, mentre con il trattamento con LPS+mtDNA si ha un aumento di circa 2,7 volte. Questa osservazione suggerisce che nel citoplasma si ha in parte rilascio di mtDNA dai mitocondri dopo stimolazione con LPS, in parte si ha endocitosi di mtDNA esogeno quando presente. Abbiamo successivamente valuato alcuni fattori chiave della via del TLR-9 e dell’inflammasoma. L’analisi della pathway di attivazione a valle di TLR-9 ha mostrato che l’mtDNA in combinazione con l’LPS è in grado di indurre l’attivazione di NF-kB, e che tale capacità di attivazione è mantenuta anche nei soggetti settantenni. L’analisi dei livelli relativi di NLRP3 e ASC, legati al sensing dell’mtDNA da parte dell’inflammasoma ha mostrato una maggiore responsività dei monociti di soggetti anziani sia all’LPS che all’mtDNA+LPS in confronto ai soggetti giovani. È stato possibile analizzare solo due soggetti ultranovantenni, nei quali abbiamo osservato una paradossale downregolazione di NRLP3 in seguito a stimolazione con mtDNA o mtDNA+LPS. Seppur preliminari, questi dati suggeriscono che i) l’mtDNA è in grado di attivare i monociti solo in combinazione con LPS; ii) la stimolazione con LPS o LPS+mtDNA aumenta il livello di mtDNA extramitocondriale e iii) che i monociti dei soggetti anziani conservano la capacità di rispondere all’mtDNA.
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