Riassunto analitico
Le Neoplasie Mieloproliferative (MPN) sono disordini clonali che originano dalla cellula staminale emopoietica midollare e comportano l’overproduzione di cellule mieloidi mature. Le MPN classiche comprendono: Policitemia Vera (PV), Trombocitemia Essenziale (ET) e Mielofibrosi Primaria (PMF). Fra le mutazioni drivers che contribuiscono all’insorgenza di ET e PMF vi sono quelle del gene Calreticulina (CALR). CALR è una proteina residente principalmente nel Reticolo Endoplasmatico (RE), dove controlla il folding proteico e regola l’omeostasi del Ca2+. CALR è anche in grado di regolare funzioni al di fuori del RE, come la risposta agli stress cellulari. Le forme mutate di CALR contengono inserzioni o delezioni nell’esone 9 che ne pregiudicano la capacità di legare il Ca2+ e rimanere all’interno del RE. Ad oggi si ritiene che CALR-mutata eserciti la propria funzione oncogenica interagendo con il recettore della Trombopoietina MPL, attivando la via JAK-STAT e favorendo la proliferazione megacariocitaria tipica della ET. Allo scopo di identificare eventuali ulteriori meccanismi oncogenici mediati da CALR ed indipendenti dall’interazione con MPL, abbiamo overespresso CALR wild-type (wt), e le due forme più frequentemente mutate nei pazienti di MPN (CALRins5 e CALRdel52) nella linea cellulare K562, priva dell’espressione di MPL. L’analisi del profilo trascrizionale (GEP) delle linee così generate, ha mostrato nelle K562 CALR-mutate la downregolazione di geni appartenenti a pathways relative a stress del RE e stress ossidativo. Innanzitutto, abbiamo valutato se la mutazione di CALR alterasse la risposta allo stress del RE. I nostri risultati mostrano che le K562 CALR-mutate non riescono ad attivare la risposta UPR (Unfolded Protein Response) per poter contrastare l’accumulo di proteine misfolded. In particolare, in queste cellule abbiamo rilevato la mancata attivazione della via PERK, che se fortemente attivata promuove la morte cellulare. In accordo con gli effetti biologici indotti dalla pathway PERK, le K562 CALR-mutate mostrano livelli di apoptosi inferiori rispetto alla linea wt in risposta a stress del RE, suggerendo che la mancata attivazione della via PERK promuova la sopravvivenza delle cellule mutate. Successivamente, abbiamo valutato se CALR-mutata alterasse la risposta allo stress ossidativo. I nostri dati mostrano che le mutazioni di CALR aumentano la sensibilità delle cellule allo stress ossidativo a causa di difetti all’enzima antiossidante Superossido Dismutasi (SOD), che non è in grado di contrastare l’accumulo di ROS intracellulari. Il maggiore tasso di stress ossidativo causa inoltre l’accumulo di danni ossidativi al DNA che non vengono riparati, causando instabilità genetica. Per comprendere infine i meccanismi biologici alla base dell’alterata risposta allo stress ossidativo nelle cellule CALR-mutate, abbiamo studiato la funzione del gene antiossidante OXR1, downregolato nelle K562 CALR-mutate secondo l’analisi di GEP. Il silenziamento di OXR1 in cellule CD34+, dalle quali originano le MPN, contribuisce all’accumulo di ROS e danni al DNA. La downregolazione di OXR1 impedisce inoltre alle cellule di riparare le lesioni al DNA, favorendo fenomeni di mutagenesi. Il mio progetto di tesi ha quindi dimostrato che CALR-mutata promuove l’oncogenesi MPL-indipendente ostacolando la risposta a stress del RE e stress ossidativo. In particolare, il blocco della pathway PERK della risposta UPR ne inibisce la sua attività pro-apoptotica favorendo potenzialmente la sopravvivenza delle cellule tumorali dei pazienti di MPN. Inoltre, diversi meccanismi fra cui la downregolazione di OXR1 impediscono alle cellule CALR-mutate di contrastare l’accumulo di danni ossidativi al DNA, provocando fenomeni di instabilità genetica tipici delle MPN.
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