Riassunto analitico
Gli studi proteomici sono rivolti allo studio delle proteine presenti in una cellula o in un tessuto, dei loro livelli di espressione e/o della loro modulazione, in seguito al trattamento con un farmaco. Gli studi di proteomica totale consentono di fotografare la totalità delle proteine presenti in un dato momento del ciclo di replicazione; il confronto tra due proteomi dello stesso tipo di cellule o tessuto, caratterizzati da eventi diversi è la proteomica differenziale. Questi studi sono rilevanti nel campo della ricerca oncologica al fine di individuare le proteine differenzialmente espresse tra cellule cancerose e cellule sane, oppure tra cellule trattate/non trattate con un farmaco. Le informazioni ottenute sono traslate nella pratica clinica per la caratterizzazione molecolare dei tumori a fini diagnostici e prognostici.
Studiado un farmaco, in fase di sviluppo pre-clinico e in ambito traslazionale, è possibile caratterizzare le proteine coinvolte nella risposta associata al meccanismo d’azione, prevedere quali proteine saranno coinvolte nei meccanismi di resistenza e nuove combinazioni di farmaci o nuovi target.
Il mio progetto di tesi si è inserito nell’ambito di uno studio di proteomica differenziale, in campo farmaceutico, focalizzato allo studio dell’attività di un chemioterapico antitumorale Pemetrexed su linea cellulare di cancro ovarico, A2780. PMX è un analogo dell’acido folico usato come antimetabolita chemioterapico. Bloccare la sintesi dei precursori purinici e pirimidinici agendo su quattro enzimi chiave: timidilato sintasi, diidrofolato reduttasi,glicinamide-ribonucleotide-formiltransferasi e 5-aminoimidazole-4-carboxamide-ribonucleotide-formyltransferase. L’azione multi-target inibisce la formazione del DNA quindi la replicazione delle cellule tumorali.
Questo farmaco è usato, da solo o combinato, come primo trattamento di tumore non a piccole cellule del polmone, adenocarcinoma e mesotelioma polmonare. Il PMX è indicato come farmaco di seconda o terza linea in altri tumori come il carcinoma ovarico, tipo di tumore grave con prognosi spesso negativa (75% delle pazienti recidive).
L’obiettivo della mia tesi è di caratterizzare meglio il meccanismo d’azione del PMX su linee cellulari di tumore ovarico studiate, identificare un set di proteine caratterizzante la risposta al farmaco (early discovery di biomarker farmacodinamici) e suggerire nuove terapie di combinazione del PMX con altri farmaci, per aumentare gli effetti terapeutici minimizzando quelli collaterali e l’insorgenza di resistenze.
Per raggiungere ciò ho svolto le seguenti attività:1) studio bioinformatico delle proteine differenzialmente espresse ottenute mediante analisi di spettrometria di massa;2) caratterizzazione della cascata di eventi molecolari innescati dal trattamento col farmaco;3) integrazione delle informazioni ottenute con le informazioni già disponibili in letteratura.
Ho utilizzato i seguenti strumenti:1) analisi bioinformatica del set di proteine sperimentali mediante clustering, functional annotation, overrepresentation test, protein-protein interaction analysis tramite diversi software (Panther, DAVID, STRING);2) analisi e revisione della letteratura disponibile riguardo al meccanismo d’azione e resistenza al PMX, compilazione di un set di proteine coinvolte (set di proteine da letteratura), confronto di questo set con quello sperimentale e integrazione delle informazioni ottenute da entrambi i set.
Il risultato di questo studio ha condotto all’identificazione di un set di proteine che caratterizzano l’azione del farmaco,associate a meccanismi di resistenza e predittive di possibili combinazioni terapeutiche
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Abstract
Drug discovery as well as well known drugs repourposing for further application and the prediction of combination therapies are based on cellular studies about their mechanisms.
Proteomics studies through mass spectrometry represent a wide approach about drugs mechanisms of action.
Proteomics studies are focused on proteins present in cells or tissues, on their expression levels and/or their modulation following drug treatment. Total proteomics studies, in particular, allow us to have a snapshot of the entire proteome present at a particular stage of the cell replication cycle; comparison between two proteins sets derived from the same cell line or tissue characterized by different evets compose the differential proteomic field. These studies play a crucial role in oncological research contest in order to identify differential expressed proteins between tumor and healthy cell, as well as treated and control cells. Information retrieved are so transposed into clinical practice for the molecular neoplasia characterization with diagnostic, in first case, and prognostic, in the second one, aims.
During studies around drugs, both in pre-clinical development stage and in translational contest it is possible to characterize proteins involved in response related to its mechanism of action, to predict which proteins will be involved in resistance mechanisms as well as predict novel combination therapies or novel therapeutic targets.
My thesis project takes part of a differential proteomic study in pharmaceutical contest, focused on studying a chemotherapy antineoplastic agent, Pemetrexed, on A2780 ovarian cancer cell line.
Pemetrexed is a folate acid analog molecule acting as antimetabolite with chemotherapy effects: it is able to block purine and pyrimidine precursors biosynthesis by inhibition of four key enzymes: thymidylate synthase, dihydrofolate reductase, glycinamide ribonucleotide synthetase and 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide formyltransferase. The multi-target effects of this drug inhibit DNA replication and tumor cells growth. Pemetrexed is administrated alone or in combination with other drugs, as first line treatment against non-small-cell lung cancer, adenocarcinoma and pleural mesothelioma. Moreover, Pemetrexed is suggested as second or third line treatment in several solid tumors such as ovarian carcinoma (www.drugbank.ca): this kind of neoplasia shows often unfavorable prognosis (75% recurrent patients).
The aim of my thesis is to well characterize Pemetrexed mechanism of action on the ovarian cancer cell line and to identify a protein set able to characterize the response to drug treatment (early discovery of pharmacodynamic biomarkers) and to predict novel combination therapies composed of Pemetrexed and other drugs, leading to an increase of therapeutic effects minimizing, contextually, collateral effects and the arise of resistance.
In order to reach such aims I performed the following activity: (1) bioinformatic analysis on differential expressed proteins set obtained by mass spectrometry analysis, (2) characterization of the molecular events cascade triggered by drug treatment, (3) integration of the obtained information with other still present in literature.
In particular, the following methods were used: (1) experimental proteins set bioinformatic analysis through clustering and functional annotation analysis, overrepresentation test and protein-protein interaction analysis using several software (Panther, DAVID, STRING); (2) Pemetrexed mechanism of action and resistance related available literature analysis and review, involved proteins set compilation (literature proteins set), comparison between these two mentioned data sets and integration of the obtained information by both sets.
Results lead to the identification of a proteins set characterizing the action of Pemetrexed, associated to resistance mechanism and predictive of potential combination therapies
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