Riassunto analitico
Questo progetto di tesi è stato svolto nell’ambito del progetto Erasmus+ presso la Facoltà di Farmacia dell’Università di Salamanca, dove è stato studiato l’effetto neuroprotettivo di estratti di Cannabis sativa L. non psicotropa e del cannabidiolo (CBD) sugli organismi modello Caenorhabditis elegans. I ceppi di nematodi scelti per lo studio esprimono proteine che nell’uomo sono ritenute possibili cause della neurodegenerazione che porta all’Alzheimer. Tali ceppi comprendono il CL2006, che esprime la proteina β-amiloide, il BR5270, che esprime una mutazione della proteina tau e il BR5271, che rappresenta un controllo del precedente, in quanto possiede la stessa proteina con una seconda mutazione che ne impedisce l’aggregazione, portando a un fenotipo più simile al wild-type. I nematodi sono stati cresciuti utilizzando il substrato Nematode Growth Factor (NGM), su cui è stato seminato il batterio E. coli OP50, fonte di nutrimento. I campioni in analisi sono stati diluiti con DMSO e dispersi nell’NGM alla concentrazione di 5 μM. Più nel dettaglio, i campioni testati sono tre: CBD puro, OIL1 (ovvero un estratto di canapa privo di terpeni) e OIL2 (un estratto di canapa ottenuto con un metodo che permette di ottenere cannabinoidi e terpeni). Nello specifico, è stato eseguito il saggio di longevità sul ceppo CL2006, confrontando le variazioni in vita media e vita massima tra i nematodi trattati con OIL2 e quelli trattati con il solo solvente. Il saggio di longevità è stato condotto anche sul ceppo BR5270, confrontando stavolta tutti e tre i campioni col solvente allo stesso tempo. Infine, il ceppo BR5270 è stato testato anche tramite il saggio di chemiotassi, il cui scopo è quello di valutare se il trattamento migliora le capacità neuronali olfattive. Il ceppo di controllo è stato utilizzato per valutare l’entità del danno causato dalla presenza di accumuli della proteina tau. Per paragonarle, è necessario calcolare il parametro “indice di chemiotassi” (C.I.): più i nematodi migrano verso la sostanza chemio-attraente (un composto rilasciato dai batteri di cui si nutrono) più alto sarà questo parametro. Un trattamento efficace porterà ad un aumento del C.I. rispetto allo stesso ceppo BR5270 trattato con DMSO, portandolo più vicino al C.I. del ceppo di controllo BR5271.
I risultati ottenuti sono piuttosto incoraggianti. Il primo saggio ha dimostrato che esiste una differenza significativa (p<0.001) tra il trattamento con OIL2 e quello con DMSO, dimostrando quindi che la compresenza di cannabinoidi e terpeni esercita un effetto sinergico tale per cui la tossicità sul lungo termine degli accumuli di β-amiloide viene ridotta. Il secondo saggio invece ha portato a risultati significativi (p<0.01) solo per il CBD. L’ultimo saggio invece è significativo per OIL2 (p<0.05). Sul modello che coinvolge la proteina tau, sul lungo termine è la sola molecola di CBD ad avere effetti positivi, probabilmente tramite un’azione diretta del CBD nell’ostacolare la formazione di aggregati proteici. Nell’altro saggio, invece, è l’attivazione del sistema endocannabinoide (ECS) che probabilmente conduce ad una migliore risposta allo stimolo, grazie alla presenza di cannabinoidi e terpeni. Ulteriori studi sono necessari per confermare i dati sperimentali in vivo ottenuti sugli oli e sul CBD.
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Abstract
This thesis’ project was carried out in the Faculty of Pharmacy in the University of Salamanca, as part of the Erasmus+ mobility programme. Herein, the neuroprotective effects of pure cannabidiol (CBD) and two non-psychotropic Cannabis sativa L. extracts were investigated over model organism Caenorhabditis elegans. Worms’ strains involved in this study express some human proteins suspected to trigger the typical neurodegeneration that leads to Alzheimer’s disease. Chosen strains were: CL2006, which expresses β-amyloid, BR5270, which expresses a mutation in tau protein, and BR5271, that represents a control strain of the previous one because it owns the same protein with a second mutation that hinder aggregation, leading to a phenotype more similar to the wild-type’s one. Nematodes were grown over the substrate Nematode Growth Factor (NGM) seeded with bacterial strain E. coli OP50, a nutritional food source for them. Samples were diluted with DMSO and incorporated into NGM, reaching a final concentration of 5μM. More in detail, three samples were tested: pure CBD, OIL1 (a hemp extract free of terpenes) and OIL2 (a hemp extract obtained with a method that allows to obtain cannabinoids and terpenes). In particular, a longevity assay was carried out over strain CL2006, evaluating variations in average and maximum lifespan concerning nematodes treated with OIL2 versus solvent treatment. A longevity assay was carried out also over strain BR5270, comparing the three samples with the solvent at the same time. In the end, strain BR5270 was tested also with the chemotaxis assay, which aim is to evaluate if the treatment ameliorates olfactory neuronal abilities. Control strain was involved in order to assess how impactful was the damage caused by tau tangles’ presence. To compare the two situations, it’s necessary to calculate the parameter “chemotaxis index” (C.I.): the more worms migrate towards the chemo-attractant substance (a compound released by bacteria on which they feed on), the more the parameter upsurges. A successful treatment leads to an increase in the C.I. paralleled to the same strain treated with DMSO, getting closer to C.I. of control strain BR5271.
The achieved results are encouraging. First assay proved that exists a strong significative difference (p<0,001) between OIL2 treatment and solvent, demonstrating that the co-presence of cannabinoids and terpenes has a synergic effect that reduces the toxicity of β-amyloid deposits on the long term. The second assay led to significative results (p<0.01) only for CBD. The last assay, instead, was significative only for OIL2 (p<0,05). Over the model that involves tau protein, on the long term, it’s the molecule of CBD alone that exerts positive effects, probably deriving from a direct interaction between CBD and tau protein, hampering tau’s aggregation. In the other assay, on the contrary, it’s perhaps endocannabinoid system’s (ECS) activation that leads to a better response to the stimulus, thanks to the presence of cannabinoids and terpenes. Further studies are necessary in order to confirm the in vivo experimental data obtained for oils and CBD.
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