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Background e obiettivo: il rugby è uno sport di contatto dove gli atleti subiscono molte collisioni, con l’accumulo di lesioni cerebrali traumatiche (TBI), durante la carriera. Inoltre, i giocatori mostrano contusioni, distorsioni, strappi muscolari e danni ad articolazioni e legamenti che promuovono l’infiammazione. Pertanto, il DNA mitocondriale (mtDNA) è rilasciato in circolo come marker di danno e può agire come DAMP regolando la risposta infiammatoria. L'obiettivo è indagare le possibili correlazioni tra mtDNA libero (cf-mtDNA), citochine, parametri ematici, neurofilamenti leggeri (NfL) e ripetuti colpi in testa. Questo potrebbe contribuire a identificare un marker precoce di danno cerebrale, per prevenire l'insorgere di malattie neurodegenerative.
Metodi: 13 giocatori di rugby, tra i 18 e i 30 anni, sono stati arruolati da una squadra professionistica nella stagione 23-24 dello United Rugby Championship. I campioni di sangue sono stati raccolti prima e subito dopo la partita per due incontri, a distanza di un mese tra loro, e circa un mese dopo la fine della stagione. Sono stati analizzati 52 parametri ematici e il sangue è stato processato per separare PBMC e plasma. Il DNA totale è stato estratto da 200μl di plasma e sono stati quantificati il DNA nucleare e l’mtDNA tramite Droplet Digital PCR (ddPCR), usando rispettivamente i primer EIF2C1 e mtND2. Poiché l’mtDNA può essere presente in più forme nel plasma, è stato effettuato un protocollo per separare tre frazioni di plasma arricchite in vescicole contenenti mitocondri, mtDNA legato a proteine e mtDNA nudo. In ogni frazione, i livelli e l'integrità dell’mtDNA sono stati misurati come descritto sopra. NfL e diverse citochine infiammatorie sono state quantificate con la tecnologia ELLA. L'eventuale correlazione tra mtDNA, fattori solubili e parametri ematici è stata valutata con il test di correlazione di Spearman e l'analisi di regressione lineare con Prism 9.0.
Risultati: I livelli di mtDNA sono aumentati non solo dopo ogni partita, ma anche progressivamente durante la stagione e un mese dopo la fine della stagione, con un effetto cumulativo. Le analisi del sangue mostrano una diminuzione di globuli rossi, emoglobina ed ematocrito dopo ogni partita, compensata dall’aumento di reticolociti. Gli enzimi epatici mostrano valori elevati negli atleti, così come i sali minerali che tendono a calare subito dopo l'attività sportiva, come da letteratura. Inoltre, la creatinina aumenta dopo l'attività sportiva e poi si normalizza, così come TSH e cortisolo. Infine, i livelli di PBMC aumentano subito dopo la partita per poi tornare ai valori iniziali. I livelli di NfL non subiscono variazioni, mentre le citochine tendono ad aumentare dopo ogni partita per poi tornare a livello basale. Inoltre, è stata trovata una correlazione tra i livelli di mtDNA prima del primo incontro e l'emoglobina corpuscolare media, la somatotropina, l'acido urico, i trigliceridi, le LDL, il glucosio, il cortisolo e le cellule immunitarie coinvolte nella risposta infiammatoria, come i linfociti, dopo il primo e il secondo incontro.
Conclusioni: L'aumento progressivo di cf-mtDNA suggerisce che non solo l'attività fisica, ma soprattutto la TBI hanno un impatto diretto sul rilascio di mtDNA e ne determinano l'accumulo nel tempo. Questo effetto può attivare vie infiammatorie favorendo la progressione di uno stato infiammatorio che è associato a possibili danni neurologici. Pertanto, i livelli circolanti di mtDNA potrebbero essere un possibile marker per rilevare i danni cerebrali causati dalle lesioni alla testa, tipiche degli sport di contatto, e prevenire le malattie neurodegenerative, tra cui la demenza, la malattia di Alzheimer, la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e l'encefalopatia traumatica cronica (CTE).

Background and aim: Rugby is a contact sport where the athletes suffer numerous hits and collisions, that lead to the accumulation of traumatic brain injury (TBI), during their career. In addition, rugby players show contusions, sprains, muscle strains, and joint and ligament damage that promote an inflammatory state. As a result of this, mitochondrial DNA (mtDNA) is released into the circulation as a marker of damage and can act as a DAMP (damage associated molecular patterns) to regulate the inflammatory response. The goal is to investigate the possible correlations between cell free-mtDNA (cf-mtDNA), cytokines, main blood parameters, light neurofilaments (NfL), and the occurrence of repeated head blows. This could help to identify an early marker of brain damage that could prevent the onset of neurodegenerative diseases. Methods: Thirteen male rugby players, aged between 18-30, were enrolled from a professional team during the United Rugby Championship season 2023-24. Venous blood samples were collected at rest before the match and immediately after the match for two matches one month apart, and about one month after the end of the season. A panel of 52 hematochemical parameters was analyzed, and blood samples were processed to separate PBMCs and plasma. Starting from 200μl of plasma, total DNA was extracted and nuclear DNA and mtDNA were quantified by Droplet Digital PCR (ddPCR), using respectively EIF2C1 and mtND2 primer assays. As mtDNA can be present in different forms in plasma, we set up a protocol to separate three different plasma fractions enriched in mitochondria-containing vesicles, mtDNA bound to proteins and naked mtDNA. In each fraction, mtDNA levels and integrity were measured as described above. NfL and several inflammatory cytokines were quantified using ELLA technology. The possible correlation between mtDNA, soluble factors, and blood parameters were evaluated using Spearman correlation test and linear regression analysis using Prism 9.0. Results: MtDNA levels increased not only after each match, but also progressively during the season and one month after the end of the season, suggesting a cumulative effect. Blood analysis show a decrease in red blood cells, hemoglobin, and hematocrit after each match, that is offset by an increase in reticulocytes. Liver enzymes have elevated values in athletes, as well as mineral salts which tend to decrease immediately after sports activity, according to the literature. Moreover, creatinine increases after sports activity and then normalizes, as do TSH and cortisol. Finally, PBMCs levels increase immediately after the match and then return to pre-match values. NfL levels do not change, whereas cytokines tend to increase after each match and then return to basal levels. In addition, we found a correlation between mtDNA levels before the first match and mean corpuscular hemoglobin, somatotropin, uric acid, triglycerides, LDL, glucose, cortisol and immune cells involved in inflammatory response, such as lymphocytes, after the first and the second match. Conclusion: The progressive increase of cf-mtDNA levels suggests that not only physical activity, but especially TBIs directly impact on mtDNA release and lead to its accumulation over time. This effect may activate inflammatory pathways favoring the progression of an inflammatory state that is associated with possible neurological damages. Therefore, circulating mtDNA levels could be a possible marker to detect brain damage caused by head injuries, typical of contact sports, and prevent sport-related neurodegenerative diseases, including dementia, Alzheimer disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), and chronic traumatic encephalopathy (CTE).