Riassunto analitico
Il fattore di trascrizione nucleare Y (NF-Y) è un fattore di trascrizione trimerico legante CCAAT il cui reguloma, interattoma e potenziale oncogenico indicano un coinvolgimento diretto nella trasformazione cellulare (Dolfini et al., 2019). Dati di ricerca precedenti mostrano che la sovraespressione della sua subunità A (NF-YA) provoca una deregolamentazione di molti geni pro-crescita dipendenti da CCAAT nel BRCA (cancro al seno) e in altri tumori.
Inoltre, NF-YA può essere trovato in due diverse forme, NF-YAs (isoforma corta) e NF-YAl (isoforma lunga), che potrebbero essere associate a diversi stadi di progressione del tumore.
I biosensori sono dispositivi in grado di effettuare una rilevazione sensibile e selettiva di un'ampia gamma di bersagli (come molecole, proteine, oligonucleotidi fino a virus e cellule intere), grazie alla loro sinergia con sonde biologiche naturalmente specializzate, o ingegnerizzabili, per un obiettivo specifico. In questo lavoro abbiamo utilizzato transistor EGOFET in cui il processo di bioriconoscimento avviene su un elettrodo in cui si trova l'intero sistema e che interagisce con un transistor organico a semiconduttore. A causa delle variazioni delle proprietà elettriche associate al fenomeno di riconoscimento, viene influenzata la modulazione operata dall'elettrodo di rilevamento sul semiconduttore, determinando una variazione misurabile del segnale trasdotto.
Un dispositivo EGOFET top gated basato su TIPS-Pentacene è stato realizzato per eseguire la rilevazione del fattore di trascrizione NF-Y nella sua forma trimerica, funzionalizzando l'elettrodo di gate con un monostrato autoassemblato e immobilizzando su di esso un oligonucleotide di DNA a doppio filamento contenente il sequenza CCAAT. È stata anche eseguita la rilevazione della sequenza di DNA stessa, immobilizzando un singolo filamento sul dispositivo e incubando nell'oligonucleotide complementare a filamento singolo invece di NF-Y.
Obiettivo principale dello studio è realizzare il primo biosensore EGOFET per la rilevazione di un fattore di trascrizione, ovvero il trimero NF-Y con l'isoforma lunga della subunità A. Questa ricerca potrebbe essere un valido punto di partenza per la creazione di un potente strumento per entrambi studi di interazione DNA-TF in vitro e analisi cliniche nella diagnostica e caratterizzazione dei tumori, mediante discriminazione e quantificazione delle due isoforme NF-YA.
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Abstract
Nuclear transcription Factor Y (NF-Y) is a CCAAT-binding, trimeric transcription factor whose regulome, interactome and oncogenic potential point to direct involvement in cellular transformation. Previous research data shows that the overexpression of its A subunit (NF-YA) results in a deregulation of many CCAAT-dependent pro-growth genes in BRCA (Breast cancer) and other tumors.
Moreover, NF-YA can be found in two different forms, NF-YAs (short isoform) and NF-YAl (long isoform), which could be associated with different progression stage of the tumor.
Biosensors are devices capable of performing a sensitive and selective detection of a wide range of targets (such as molecules, proteins, oligonucleotides up to virus and whole cells), thanks to their synergy with biological probes which are naturally specialized, or can be engineered, for a specific target. In this work we used Electrolye-Gated Field-Effect Transistors (EGOFET) where the biorecognition process takes place on an electrode where the whole system is located, and that interacts with an organic semiconductor-based transistor. Due to the changes in electrical properties associated to the recognition phenomenon, the modulation operated by the sensing electrode on the semiconductor is affected, resulting in a measurable variation of the transduced signal.
A TIPS-Pentacene based, top gated EGOFET device was realized to perform the detection of NF-Y transcription factor in its trimeric form, by functionalizing the gate electrode with a self-assembled monolayer and immobilizing onto that a double-strand DNA oligonucleotide containing the CCAAT sequence. Detection of the DNA sequence itself was also performed, by immobilizing a single strand onto the device and incubating in the complementary single strand oligonucleotide instead of NF-Y.
Main goal of the study is to realize the first EGOFET biosensor for the detection of a transcription factor, namely NF-Y trimer with the long isoform of subunit A. This research could be a valid starting point for the creation of a powerful tool for both in vitro DNA-TF interaction studies and clinical analysis in tumor diagnostics and characterization, by discrimination and quantification of the two NF-YA isoforms.
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