Riassunto analitico
Le Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMOs) sono metallo-proteine di recente scoperta, trovate in batteri, funghi e artropodi, capaci di degradare attraverso un meccanismo ossidativo polisaccaridi recalcitranti, come ad esempio chitina e cellulosa. L'importanza delle LPMOs nei processi industriali di bioraffineria è dimostrata dalla loro recente inclusione nei cosiddetti "cocktail enzimatici" utilizzati per la degradazione delle biomasse lignocellulosiche. Nonostante l'intenso studio negli ultimi anni di tali sistemi, molti aspetti riguardanti la (bio)chimica e il meccanismo d'azione delle LPMOs rimangono ambigui e necessitano di ulteriore delucidazione. Inoltre, la recente scoperta di LPMOs di differenti origini e peculiari caratteristiche dimostra che questa superfamiglia di metallo-enzimi è in continua espansione e che la nostra conoscenza al riguardo è ancora limitata.
In quest'ottica diventa essenziale lo sviluppo di protocolli rapidi ed efficaci per l'identificazione, la produzione e la caratterizzazione delle LPMOs. Una delle principali difficoltà che si riscontrano durante la produzione ricombinante di una LPMO è data dalla necessità di ottenere la forma attiva della proteina, contenente un'istidina libera come residuo N-terminale. In questo lavoro, la proteina AoAA11 di origine fungina è stata prodotta seguendo un protocollo consolidato, basato sulla purificazione dallo spazio periplasmatico di E.coli. Diversamente, la proteina PpAA10, derivante dal batterio gram-negativo Pseudomonas putida, è stata prodotta per via ricombinante e purificata per la prima volta, seguendo una strategia basata sull'utilizzo di un clonaggio indipendente dalla ligation, accoppiato al trattamento del prodotto di espressione con una specifica proteasi chiamata WelQut®, per rimuovere gli amminoacidi indesiderati presenti all'N-terminale. Saggi di SDS-PAGE e l'analisi con spettrometria di massa hanno confermato il successo di questa procedura. La seconda parte del progetto ha riguardato invece la caratterizzazione e il confronto tra le due proteine prodotte, attraverso lo studio di proprietà biochimiche, spettroscopiche e elettrochimiche. L'analisi con spettrometria MALDI-TOF ha dimostrato che entrambi gli enzimi sono attivi sulla chitina e producono oligosaccaridi solubili con ossidazione in posizione C1. Inoltre, in assenza di una struttura cristallografica, la struttura del sito attivo di PpAA10 è stata indagata mediante spettroscopia EPR, rivelando un centro metallico classificato come "type II copper center", con una geometria di coordinazione altamente dipendente dal pH. A bassi valori di pH, la geometria del sito attivo e’ in accordo con quanto riportato in letteratura per altre AA10s. Infine, è stata condotta una stima dei potenziali standard di ossidoriduzione delle coppie AoAA11-Cu2+/Cu1+ e PpAA10-Cu2+/Cu1+, per ottenere informazioni preliminari sul meccanismo di trasferimento elettronico di questi enzimi.
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Abstract
Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMOs) are recently-discovered metalloenzymes, found in bacteria, fungi and arthropods, which are capable of degrading recalcitrant polysaccharides, such as cellulose and chitin, via an oxidative mechanism. The importance of LPMOs employment in industrial biorefinery processes is demonstrated by their recent inclusion in enzymatic preparations for the degradation of lignocellulose. Despite intense efforts to investigate these systems, many aspects of their biochemistry and mechanism of action remain unclear and need further investigations. Moreover, the recent discovery of enzymes from different origins and with unique properties, shows that the LPMO superfamily is in continuous expansion.
In this respect, the development of rapid and effective protocols for identification, production and characterization of LPMOs is essential. One major obstacle in the recombinant expression of LPMOs is the need to obtain the active form of the protein with the copper-coordinating histidine as the N-terminal residue. In this work the fungal-derived AoAA11 was produced according to a consolidated periplasmic expression-based protocol. On the contrary, PpAA10, a novel LPMO from the gram-negative bacterium Pseudomonas putida, was heterogeneously expressed and purified for the first time following a different strategy. This method is based on the usage of a ligation-free cloning procedure coupled with the treatment of the expression product with a WelQut® protease in order to remove unwanted N-terminal residues. SDS-PAGE assays and Peptide Mass fingerprinting analysis confirmed that the strategy was successful. The second part of the project was focused on the characterization and comparison of the two expressed LPMOs: biochemical, spectroscopic and redox properties were investigated. MALDI-TOF assays demonstrated that both enzymes are chitin-active LPMOs and produce C1-oxidized soluble oligosaccharides. Moreover, in the absence of a crystal structure, the arrangement of PpAA10 active site was studied by EPR spectroscopy, revealing a type II copper center with a coordination environment highly sensitive to pH. At low pH values, the geometry of the active site was found to be consistent with what reported in the literature for other AA10s. Finally, preliminary estimations of AoAA11-Cu2+/Cu1+ and PpAA10-Cu2+/Cu1+ redox potential were performed, to gain a first insight on the electron-transfer mechanism of the two enzymes.
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