Riassunto analitico
La Mielofibrosi Primaria (PMF) fa parte delle Neoplasie Mieloproliferative (MPN) BCR/ABL negative ed è causata da alterazioni del processo di proliferazione clonale della cellula staminale emopoietica che determinano un'iperplasia megacariocitaria a livello midollare. La PMF è caratterizzata anche da: fibrosi midollare, osteosclerosi, neoangiogenesi e anomala mobilizzazione delle cellule CD34+. Gli studi molecolari volti a identificare i meccanismi patogenetici delle MPN hanno permesso di individuare mutazioni nei geni JAK2, MPL e CALR. Oltre a queste mutazioni, recentemente sono stati descritti altri meccanismi tra cui l'alterata espressione dei miRNA. Per caratterizzare meglio il ruolo dei miRNA nello sviluppo della PMF, nel laboratorio in cui ho svolto l'internato di tesi è stato condotto uno studio di analisi integrata dei profili di espressione genica e dei miRNA in cellule CD34+ di PMF. Dato che i miRNA inibiscono l'espressione genica principalmente degradando gli mRNA target, l'analisi integrata ha permesso di individuare coppie miRNA-mRNA predette computazionalmete che presentano un'espressione anticorrelata nelle cellule CD34+ di PMF. I risultati hanno riportato miR-494-3p come il miRNA upregolato associato al maggior numero di target anticorrelati e quindi, in questo lavoro di tesi, abbiamo deciso di approfondire il suo ruolo nell'emopoiesi fisiologica e patologica. Lo studio dell’espressione di miR-494-3p in cellule CD34+ normali ha evidenziato che la sua espressione aumenta nelle cellule indotte al differenziamento megacariocitario. miR-494-3p è stato quindi overespresso in cellule CD34+ normali attraverso la nucleofezione di miRNA mimic specifici e le analisi immunofenotipica, morfologica, ed i saggi clonogenici, hanno mostrato che la sua overespressione stimola la megacariocitopoiesi in cellule CD34+. Al contrario, l'inibizione di miR-494-3p in cellule CD34+ di PMF, ottenuta mediante nucleofezione di oligonucleotidi Locked Nucleic Acid, ha compromesso il differenziamento megacariocitario delle cellule. Questi risultati hanno quindi suggerito che miR-494-3p sia in grado di stimolare la megacariocitopoiesi nei progenitori emopoietici. Per individuare possibili meccanismi molecolari responsabili di questo effetto abbiamo studiato il profilo di espressione genica di cellule CD34+ overesprimenti miR-494-3p attraverso la tecnica dei microarray Affymetrix. Abbiamo così individuato 134 geni differenzialmente espressi tra cui sono stati selezionati i geni da sottoporre alle successive validazioni funzionali. Confrontando questa lista con quella dei geni differenzialmente espressi in cellule CD34+ di PMF, ottenuta in precedenza nel nostro laboratorio, e individuando, tra i geni downregolati, quelli predetti in silico come target di miR-494-3p; abbiamo deciso di validare in vitro l'effetto dell'inibizione dei geni SOCS6 e HOXA10, downregolati, e di MEF2C, upregolato. Il silenziamento dei geni SOCS6 e HOXA10, ottenuto nucleofettando siRNA specifici in cellule CD34+ normali, ha avuto un effetto promuovente il differenziamento megacariocitario come dimostrato dall’analisi immunofenotipica e dai saggi clonogenici. Avendo osservato l'upregolazione di MEF2C dopo overespressione di miR-494-3p abbiamo anche deciso di inibire il gene in cellule CD34+ normali overesprimenti il miRNA. In questo caso l'analisi immunofenotipica ha rivelato che l'inibizione di MEF2C contrasta l'induzione della megacariocitopoiesi dovuta all'overespressione di miR-494-3p. Questi risultati sostengono l'ipotesi che l'upregolazione di miR-494-3p favorisca la megacariocitopoiesi nei progenitori emopoietici, e sia coinvolta nell'induzione dell'iperplasia megacariocitaria osservata nei pazienti di PMF. Inoltre, l'analisi dei profili di espressione genica ha permesso di individuare tre geni, SOCS6, HOXA10 e MEF2C, che potrebbero essere considerati, almeno in parte, responsabili dell'effetto esercitato dal miRNA sul differenziamento delle cellule CD34+.
|
Abstract
Primary Myelofibrosis (PMF) belongs to BCR/ABL negative Myeloproliferative Neoplasms (MPNs) and is due to alterations in clonal proliferation of hematopoietic stem cell that induce megakaryocyte hyperplasia in the bone marrow of patients. Bone marrow fibrosis, osteosclerosis, neoangiogenesis and abnormal CD34+ cells mobilization are other frequent features of this pathology. Studies concerning MPN’s molecular pathogenesis highlighted the occurrence of somatic mutation in several genes such as JAK2, MPL and CALR. Recent studies have suggested that also alterations in miRNAs expression could play a critical role in MPNs pathogenesis.
Based on these observations, to get further insights on the role of miRNAs in PMF development, in the laboratory where I worked for my thesis internship, an integrative analysis study was carried out on gene and miRNA expression profiles obtained from the same PMF CD34+ cells. Since one of the main mechanisms through which miRNAs inhibit gene expression is mRNA degradation, this in-silico analysis allows the identification of predicted miRNA-mRNA pairs showing anticorrelated expression in PMF CD34+ cells. Since miR-494-3p turned out to be the miRNA associated to the highest number of anti-correlated mRNAs, we decided to further investigate its role in physiologic and pathologic hematopoiesis.
miR-494-3p expression evaluation in CD34+ cells maintained in unilineage culture condition revealed that miRNA expression levels are increased during megakaryocitic differentiation. Subsequently, we obtained miR-494-3p overexpression in CD34+ cells isolated from cord blood (CB) through the nucleofection of specific miRNA mimics. To evaluate the effects of miR-494-3p overexpression on hematopoietic cells differentiation, immunophenotypic, morphological analysis, and clonogenic assays were performed; the results revealed a strong induction of megakaryocytic differentiation after miR-494-3p overexpression in CD34+ cells. On the contrary, Locked Nucleic Acid inhibition of miR-494-3p in PMF CD34+ cells impaired megakaryocytic differentiation.
Our findings suggest that miR-494-3p upregulation in CD34+ progenitor cells is able to promote megakaryocytic differentiation. In order to define the molecular mechanisms responsible for this effect, we decided to study gene expression profile of CD34+ cells overexpressing miR-494-3p by means of microarray technology. We found 134 differentially expressed genes among which we selected those for further functional validations. In particular, we compared this gene list with that of differentially expressed genes in PMF CD34+ cells and we identified miR-494-3p predicted downregulated targets according to TargetScanHuman. SOCS6 and HOXA10 were selected among the downregulated genes, whereas MEF2C was selected among the upregulated ones.
We obtained SOCS6 and HOXA10 genes inhibition in CB CD34+ cells by means of siRNA nucleofection. Immunophenotypic analysis and clonogenic assays revealed that SOCS6 and HOXA10 gene silencing was able to induce megakaryocytic differentiation in CB CD34+ cells. Since we observed MEF2C upregulation after miR-494-3p overexpression in CB CD34+ cells, we decided to concurrently overexpress miR-494-3p and to silence MEF2C in the same CD34+ cell samples through the transfection of specific miRNA mimics and siRNAs. Immunophenotypic analysis revealed that MEF2C inhibition was able to prevent megakaryocytic differentiation due to miR-494-3p overexpression in CB CD34+ cells.
As a whole our findings suggest that miR-494-3p upregulation in CD34+ progenitor cells is able to promote megakaryocytic differentiation, and it may be involved in the induction of megakaryocytic hyperplasia observed in PMF patients. Furthermore, gene expression profiling after miR-494-3p overexpression, led to the identification of three genes, SOCS6, HOXA10, MEF2C, that could be considered, at least in part, responsible for miR-494-3p effect on megakaryocytic differentiation.
|