Riassunto analitico
Negli ultimi anni le conoscenze sui meccanismi molecolari che regolano l’omeostasi del ferro sono notevolmente aumentate. Molteplici studi hanno dimostrato il ruolo cruciale dell’epcidina, un ormone sintetizzato dal fegato in grado di legare e degradare il principale esportatore di ferro intracellulare, la ferroportina. Alterazioni della regolazione dell’epcidina portano a sovraccarico di ferro (in caso di bassi livelli di epcidina circolante) come accade nell’emocromatosi ereditaria, o al contrario, a una condizione di ferro-carenza e anemia (in caso di alti livelli di epcidina circolante). La quantità circolante dell’epcidina è finemente regolata a livello trascrizionale.
Diversi studi condotti su modelli murini e in colture cellulari hanno individuato le vie che modulano la trascrizione dell’epcidina, e di conseguenza, il metabolismo del ferro. Esistono in particolare tre vie che ne stimolano la sintesi nel fegato:
• la via indotta dal ferro circolante e tissutale mediata delle BMPs (Bone Morphogenetic Proteins), che attraverso la fosforilazione e l’attivazione delle proteine SMAD, attiva il promotore dell’epcidina;
• la via infiammatoria, indotta dall’interleuchina 6 che attiva la trascrizione dell’epcidina a seguito della fosforilazione e del successivo legame del fattore STAT3 al promotore stesso.
• la via di risposta allo stress del reticolo endoplasmatico, che aumenta i livelli di espressione dell’epcidina attraverso l’attivazione del fattore trascrizionale CREB3L3 (CREBH).
Diverse BMPs sono in grado di attivare la via BMP/SMAD, ma è stato dimostrato che la BMP6 ha un ruolo preponderante rispetto alle altre. Si conosce ancora poco però sulla regolazione di questa citochina, normalmente prodotta dal fegato in risposta a variazioni del contenuto tissutale di ferro. Visto che il CREBH occupa stabilmente il promotore dell’epcidina e ha un ruolo nella sua trascrizione, abbiamo voluto studiare il rapporto fra CREBH e BMP6, il fattore più importante nella regolazione trascrizionale dell’epcidina.
A tal scopo, abbiamo innanzi tutto analizzato l’espressione dell’RNA messaggero della BMP6 nel modello murino privo del fattore trascrizionale CREBH. L’analisi mediante Real Time PCR in topi wild type e knockout per il fattore CREBH ha evidenziato la presenza di livelli di messaggero di BMP6 inappropriatamente bassi in rapporto alle rispettive concentrazioni di ferro epatico, indicando un coinvolgimento del fattore CREBH nella regolazione di BMP6 in vivo.
Successivamente abbiamo clonato la regione del promotore del gene della BMP6 umana in un vettore plasmidico a monte del gene codificante per la Luciferasi, così da poterne valutare l’attività e la regolazione in colture cellulari.
Grazie ad un’analisi dettagliata della regione clonata, abbiamo individuato un possibile sito di legame per il fattore trascrizionale CREBH. Abbiamo quindi valutato in vitro la capacità del fattore CREBH di regolare in modo diretto la trascrizione del promotore della BMP6. L’uso della forma costitutivamente attiva e di quella dominante negativa di CREBH hanno dimostrato la capacità del fattore di legarsi e regolare la trascrizione della BMP6.
In ultima analisi questo studio ha permesso per la prima volta di far luce sui meccanismi di regolazione trascrizionale della BMP6, individuando nel fattore CREBH un componente fondamentale di questa regolazione e, indirettamente, un nuovo regolatore dell’omeostasi del ferro.
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