• Flow cytometry
• HIV
• Immunophenotype
• Immunosenescence
• Liver transplant

Introduzione. Il trapianto di fegato è una terapia salvavita. Negli ultimi decenni le tecniche chirurgiche di trapianto e la terapia immunosuppressiva si sono evolute, permettendo il raggiungimento di tassi di sopravvivenza vicini al 90%. L’infezione da Human Immunodeficiency Virus (HIV) è stata a lungo considerata una controindicazione assoluta al trapianto d’organo, tuttavia, ora, i pazienti con carica virale nulla in terapia antiretrovirale possono ricevere una donazione di fegato. La morbidità e la mortalità dei pazienti sottoposti a trapianto sono spesso correlate allo stato immunologico del paziente ricevente. La citometria a flusso permette la caratterizzazione fenotipica delle sottopopolazioni delle cellule T e lo studio della funzionalità delle cellule del sistema immunitario sia nei pazienti trapiantati, che nei non trapiantati, oppure negli individui HIV positivi o negativi.

Metodi. Numeri simili di pazienti trattati nel Policlinico di Modena negli ultimi anni sono stati arruolati nello studio e suddivisi in quattro gruppi differenti: HIV+ trapiantati di fegato; HIV negativi trapiantati di fegato; HIV+ non trapiantati; soggetti sani (controlli). Per l’analisi citometrica 100 ul di sangue intero sono stati marcati con il pannello DuraClone IM I cell subsets (Beckman Coulter) contenente 10 anticorpi monoclonali liofilizzati. A questo pannello sono stati aggiunti altri 5 anticorpi monoclonali e un marcatore di vitalità cellulare, arrivando ad individuare 16 fluorescenze e 2 parametri fisici per ogni cellula. Dunque, le cellule sono state marcate con: CD45 KrO, CD3 APC-A750, CD4 APC, CD8 AF700, CD45RA FITC, CD197 PE, CD279 PC5.C, CD57 PB, CD27 PEC7, CD28 ECD, CD127 BV650, CD25 BV 785, CD14 BUV 395, CD16 BUV496, HLA-DR BUV 661 and Promokine 840, poi lasciate incubare per 20 minuti a temperatura ambiente ed infine lisate e sottoposte a lavaggi secondo procedura standard (Versalyse di BC). È stato utilizzato lo strumento CytoFLEX LX di Beckman Coulter e i dati sono stati elaborati tramite il software FlowJo 10. I test statistici sono stati effettuati con l’utilizzo di GraphPad Prism 7.



Risultati. Tutti i pazienti HIV positivi avevano carica virale nulla. La maggioranza dei pazienti trapiantati era sottoposta a terapia immunosoppressiva con Tacrolimus, inoltre non sono state evidenziate differenze tra i pazienti HIV positivi o negativi. La percentuale di cellule T CD4+ era più elevata nei controlli rispetto a tutti gli altri gruppi. La percentuale di linfociti T CD8+ era inferiore nei controlli rispetto agli altri tre gruppi. Analizzando il differenziamento dei linfociti T CD4+ e CD8+, sono state osservate diverse differenze significative. Per quanto concerne i CD4+, nel gruppo controllo sono state dimostrate percentuali di cellule naïve superiori agli altri gruppi, mentre di central memory inferiori, tuttavia nessuna differenza è stata rilevata tra la sottopopolazione di EMRA; riguardo i linfociti CD8+, i pazienti trapiantati HIV negativi mostrarono una riduzione nelle cellule T naive e un aumento nelle cellule EMRA, nei pazienti HIV+ non-trapiantati è stato rilevato un aumento nelle cellule central memory a differenza degli altri gruppi, mentre nei pazienti HIV+ trapiantati è stato evidenziato un aumento della sottopopolazione di cellule effector memory rispetto ai non trapiantati HIV+. Nel gruppo di pazienti trapiantati HIV- sono state rilevate percentuali di cellule con fenotipo senescent/exhausted significativamente elevate nelle sottopopolazioni CD4+ EM ed EMRA. È stato evidenziato Un aumento nelle cellule T CD4+ regolatorie nei pazienti trapiantati HIV+ a confronto con la popolazione controllo.
Conclusioni. I risultati ottenuti suggeriscono che i pazienti HIV negativi trapiantati presentino linfociti T più immunosenescenti a confronto con i pazienti HIV positivi trapiantati.

Introduction. Liver transplantation is a life-saving intervention. Organ replacement surgical techniques have improved in the last decades, together with the immunosuppressive therapy, allowing an almost 90% patient survival rate. Human Immunodeficiency Virus (HIV) infection was traditionally considered an absolute contraindication for transplantation, but patients with undetectable viral load under antiretroviral therapy can, nowadays, receive a donated liver. Morbidity and mortality in HIV+ patients undergoing transplantation are mainly bound to the immunological state of the host. Flow cytometry allows the characterisation of T cell subsets and the study of immune cells functionality both in transplanted or not patients, as well as in HIV+ or negative individuals. Methods. Similar number of patients treated in Modena University Hospital in the past decade were enrolled and divided in different groups: HIV+ liver-transplanted patients; HIV negative liver transplanted patients; HIV+ non-transplanted patients; healthy subjects (controls). For the cytometric analysis 100 ul of whole blood were stained with the DuraClone IM T cell subsets panel (Beckman Coulter) containing 10 lyophilized monoclonal antibodies. To this panel we were able to add other 5 mAbs and a marker of cell viability, distinguishing 16 fluorescences and two physical parameters for each cell. Therefore, cells were stained with: CD45 KrO, CD3 APC-A750, CD4 APC, CD8 AF700, CD45RA FITC, CD197 PE, CD279 PC5.C, CD57 PB, CD27 PEC7, CD28 ECD, CD127 BV650, CD25 BV 785, CD14 BUV 395, CD16 BUV496, HLA-DR BUV 661and Promokine 840, then incubated for 20 minutes at room temperature and finally lysed and washed according to standard procedures (Versalyse form BC). CytoFLEX LX flow cytometer from Beckman Coulter was used and data were elaborated through FlowJo 10 software. Statistical analyses were performed through GraphPad Prism 7. Results. All HIV+ patients had an undetectable viral load. The majority of transplanted patients were treated with tacrolimus as immunosuppressive therapy, and no differences were present between HIV+ and HIV negative patients. The percentage of CD4+ T cells was higher in controls compared to the other 3 groups. On the contrary, there was evidence of an increase in the percentage of CD8+ T cells in patients in comparison with controls. Analyzing CD4+ and CD8+ T cells differentiation we observed various significant differences among subpopulations. Regarding CD4+, controls have higher percentages of naïve cells and lower percentages of central memory cells than other patient groups, while no differences were evidenced in EMRA subset; regarding CD8+, HIV- liver transplanted patients have a reduction in naïve cells and an increase in EMRA T cells, HIV+ non-transplanted patients had a significant increase in central memory cells compared to all other groups, and HIV+ transplanted patients had higher values of effector memory cells than HIV+ non-transplanted population. HIV- liver transplanted patients showed high percentages of senescent/exhausted cells among CD4+ EM and EMRA T cells. No differences resulted in T cell activation. CD4+ regulatory T cells were increased in HIV+ transplanted patients compared to controls. Among monocyte subpopulations no differences were evidenced. Conclusions. These findings suggest that HIV negative transplanted patients have more exhausted/immunosenescent T cells compared to HIV+ transplanted patients, with a possible immunomodulatory role of immunosuppressants in HIV+ transplanted patients.