Riassunto analitico
Le molecole anfifiliche, che si ritiene abbiano un'azione sull'attività di proteine di membrana, possono interagire anche con il doppio strato lipidico stesso. I neurosteroidi agiscono su recettori di membrana delle cellule sul sistema nervoso centrale ma, data la loro natura anfifilica, il loro effetto sulla membrana è ancora discusso. Il lavoro di tesi si concentra sullo studio degli effetti di queste molecole su un sistema lipidico puro, le Giant Unilamellar Vescicles (GUVs) come modello di membrane biologiche. In particolare sono stati studiati i due neurosteoroidi Allopregnanolone (3α,5α - tetrahydroprogesterone o Allo) e la sua isoforma Isoallopregnanolone (3,5α - tetrahydroprogesterone o isoAllo), su un modello ternario composto da i lipidi DOPC/bSM/Chol in rapporto equimolare. L’Allo è noto per essere un modulatore positivo del recettore GABAa, canale permeabile al Cl, mentre l’Isoallo agisce come antagonista non competitivo sull’azione dell’Allo. Saggiandone i loro effetti, in termini di proprietà meccaniche del sistema lipidico, è stato riscontrato che l’Allo aumenta l’area dello strato lipidico e ne diminuisce i parametri meccanici. Al contrario, l’Isoallo diminuisce l’area del modello di membrana ma senza alterarne in maniera significativa le proprietà meccaniche per il range di concentrazione utilizzato (50-100nM). Inoltre, è stata caratterizzata la cinetica di assorbimento dell’Allo nello strato lipidico in modo da poter mettere in relazione questo effetto sulla membrana con l’attivazione del recettore GABAa. L’approccio per poter determinare sia le proprietà meccaniche, che la cinetica, è stato quello di aspirazione dei liposomi tramite micropipetta.
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Abstract
Amphiphilic molecules which are supposed to affect membrane protein activity could strongly interact also with the membrane itself. Neurosteroids are amphiphilic molecules that bind to plasma membrane receptors of cells in the central nervous system but, given their nature, their effect on membrane is still under debate. For this reason it is interesting to investigate their effects on pure lipid bilayers, that is Giant Unilamellar Vescicles (GUVs), as model systems The object of the thesis was that of studying the effects of a neurosteroid, Allopregnanolone (3α,5α - tetrahydroprogesterone or Allo) and of one of its isoforms, Isoallopregnanolone (3,5α - tetrahydroprogesterone or isoAllo), on the physical properties of pure lipid bilayers composed by DOPC/bSM/chol.
Allo is a well-known positive modulator of GABAA receptor activity while isoAllo acts as a non-competitive functional antagonist of Allo modulation.
The investigations were based on the usage of the Micropipette Aspiration Technique in order to attach the liposome and study its properties without and in presence of neurosteroids.
It was found that Allo, when applied to a lipid bilayer model system including cholesterol induces an increases of the lipid bilayer area and a decrease of the mechanical parameters.
Conversely, isoAllo, decreases the lipid bilayer area and, when applied at low concentrations (50-100 nM), it does not affect significantly the mechanical parameters.
The kinetics of Allo uptake by the lipid bilayer was also characterized in order to better investigate the relationship between the effect of Allo on the membrane and the GABAa receptor activation.
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