Riassunto analitico
Le neglected diseases sono un gruppo di infezioni tropicali, particolarmente endemiche nei paesi in via di sviluppo, causate da agenti batterici e virali. Dato che , ad oggi, i trattamenti terapeutici sono poco disponibili e non efficaci è sorta la necessità di identificare nuovi farmaci per combattere e controllare il diffondersi di tali malattie . La timidiliato sintasi– fad –dipendente (FDTS o ThyX) è risultata essere un bersaglio biologico di particolare interesse in questo ambito per due motivi principali : è fondamentale per la sopravvivenza del patogeno, in quanto catalizza l’unica via di sintesi del nucleotide dTMP, ed è assente nell’uomo, permettendo quindi di limitare i problemi di tossicità.
Il mio progetto di tesi ha avuto un triplice scopo: i) la messa a punto di un approccio sperimentale per la quantificazione delle velocità di scomparsa dei substrati di ThyX da Mycobacterium Tubercolosis; ii) un’ iniziale esplorazione del meccanismo d’azione di questo enzima; iii), lo screening di una serie di potenziali inibitori nei confronti di questo enzima noto comunemente come FDTS o ThyX. Tali studi sono stati condotti mediante spettroscopia di assorbimento UV/Vis che ha permesso di sfruttare la capacità dei substrati di reazione di assorbire a determinate lunghezze d’onda note. E’ stato messo a punto un metodo di analisi degli spettri UV-visibili della miscela di reazione enzimatica misurati nel tempo che ha consentito la quantificazione delle variazioni di concentrazione dei quattro substrati di ThyX e determinare, di conseguenza, le loro velocità di scomparsa e le velocità dei diversi step che compongono il meccanismo d’azione di questo enzima, meccanismo complesso e non del tutto ancora chiarito. Con questo metodo di analisi è stata determinata la dipendenza delle velocità dei due step della reazione dalle concentrazioni dei substrati per caratterizzae le proprietà di MB ThyX come enzima. Infine, è stata esplorata la capacità di diverse molecole di inibire l’enzima. Due di queste sono inibitori noti di timidilato sintasi di altri organismi. Gli altri sono composti progettati per interagire con lo stesso sito di legame del dUMP, substrato principale della proteina .
Durante questi studi è stata svolta una parentesi di analisi con sistema HPLC/MS al Centro Interdipartimentale Grandi Strumenti (CIGS) dell’Università di Modena e Reggio Emilia che ha permesso di far luce su alcune problematiche relative all’instabilità dei substrati utilizzati ed individuare quindi le condizioni idonee per effettuare gli esperimenti.
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