• GLIOMA
• MRNA
• NECROPTOSI
• RIP1
• ZFP36

La famiglia di proteine TTP comprende TTP/ZFP36, TIS11b/ZFP36L1 e TIS11d/ZFP36L2, le quali legano in modo specifico sequenze ricche di adenina ed uridina (ARE II) contenute nella regione 3' non tradotta (3'UTR) degli RNA messaggeri e ne promuove la degradazione. Queste proteine sono coinvolte in processi di differenziamento cellulare e apoptosi, nella regolazione di risposte cellulari a fattori di crescita e nello sviluppo del cancro, dal momento che sono capaci di indurre la degradazione di molti mRNA, che codificano per citochine, fattori trascrizionali, regolatori del ciclo cellulare e del programma apoptotico. ZFP36 è capace di bersagliare un elevato numero di trascritti oncogenici. In molti tumori, ZFP36 è downregolato e la sua espressione correla indirettamente con una progressione tumorale maligna.
Il glioblastoma multiforme (GBM) è un tumore primario del sistema nervoso centrale, geneticamente eterogeneo e caratterizzato da alta mortalità e morbilità. Nel glioma, ZFP36 è iperfosforilato e quindi inattivo.
Basandoci su queste evidenze, abbiamo studiato il ruolo antitumorale di ZFP36 nella linea cellulare di GBM ln827. Lo scopo dello studio è valutare gli effetti biologici del ripristino dell'espressione ectopica di ZFP36 in cellule ln827, analizzando la morte cellulare, la capacità migratoria e proliferativa. In tale contesto cellulare, l'espressione di ZFP36 riduce la capacità clonogenica e la potenzialità migratoria, aumentando la suscettibilità alla morte cellulare. Pertanto, abbiamo ipotizzato che, ripristinando l'espressione di ZFP36 potrebbe essere possibile arrestare la crescita tumorale e la chemioresistenza, in quanto molti oncogeni sono codificati da mRNA che portano sequenze ARE.
Studi precedenti su GBM dimostrano che inibitori di XIAP sensibilizzano le cellule all'apoptosi, mentre PIM1 e PIM3 agiscono reprimendo l'apoptosi e stimolando l'invasività delle cellule tumorali. Tramite saggi di luciferasi, abbiamo valutato la stabilizzazione di candidati target come XIAP, PIM1 e PIM3, in presenza di ZFP36, dato che nella regione 3'UTR mostrano sequenze ARE; successivamente, abbiamo analizzato gli effetti biologici del silenziamento genico dell'espressione di XIAP, PIM1 e PIM3, mediante saggi clonogenici e di migrazione, ed analisi dei parametri vitali.
Per quanto riguarda la morte cellulare, abbiamo osservato che ZFP36 aumenta il numero di nuclei condensati. Nonostante gli innumerevoli saggi eseguiti, sebbene sia stato confermato un incremento di morte cellulare, nessun risultato mostra chiaramente l'attivazione di un classico pathway di morte cellulare, suggerendo che ZFP36 attiva un programma di morte differente da apoptosi e necrosi. Studi sulla morte cellulare mostrano che lo stress genotossico induce la deplezione di XIAP, cIAP1 e cIAP2, portando in tal modo alla formazione del ''Ripoptosoma'', un complesso di morte costituito da RIP1, FADD e CASP8. Questo complesso indica una morte cellulare sia apoptotica che necroptotica, indipendente dal legame di TNF al recettore di morte.
Ricostituendo l'espressione di ZFP36 in ln827, si suppone che si possa ridurre l'azione di XIAP e cIAP2, portando alla formazione del ripoptosoma e alla necroptosi, in assenza di stress genotossico. A questo proposito, usando cellule HEK293T, abbiamo dimostrato che ZFP36 stabilizza RIP1, degradando cIAP2.
Inoltre, l'espressione di ZFP36, così come il trattamento con Etoposide (farmaco stabilizzante il ripoptosoma), induce la formazione di un complesso ad alto peso molecolare, in cui RIP1 è maggiormente associato alla CASP8 rispetto al FADD. L'insieme di tali evidenze suggerisce che ZFP36 determina, mediante la stabilizzazione di RIP1, l'aggregazione di un complesso di morte che spinge più verso un processo necroptotico che apoptotico.

The TTP family of tandem zinc finger proteins includes TTP/ZFP36, TIS11b/ZFP36L1 and TIS11d/ZFP36L2, which directly bind adenine-uridine rich elements (AREII sequences) located in 3'UTR of target mRNAs and promote degradation of the host transcript. TTP family members have been described as involved in cell differentiation and apoptosis, in the regulation of the cell response to growth factors and in the development of cancer, since they are capable of inducing the degradation of a large number of mRNAs, for example cytokines, transcription factors, cell cycle regulators, and apoptosis regulators. ZFP36 is capable to target a large number of oncogenic mRNAs. In many cancers, ZFP36 is downregulated and its expression correlates inversely with malignant progression. Glioblastoma multiforme is the most common and malignant subset of brain tumors and it is genetically highly heterogeneous. In glioma, ZFP36 is hyperphosphorylated and therefore inactivated. Thus, we decide to study a possible tumor suppressor role of ZFP36 in ln827 glioblastoma multiforme cell line. The aim of the study is to evaluate the biological effects of restoring the ectopic expression of ZFP36, in ln827 cell line, analyzing cell death, anchorage-independent growth and migration, and wound-healing assays. In ln827 cell line, ZFP36 expression reduces clonogenic ability and increases susceptibility to cell death coupled to a reduced migration potential of glioma cells. We suppose that, by restoring the ZFP36 expression, it could be possible to impinge on GBM growth, viability and chemoresistance, since many oncogenes are encoded by ARE carrying mRNAs. Several studies on GBM demonstrate that XIAP inhibitors sensitize cells to apoptosis and PIM1and PIM3 act by repressing apoptosis and by stimulating the invasion activity of cancer cells. Knowing this, we have evaluated the stabilization of putative target XIAP, and also of serine/threonine kinases PIM1 and PIM3, since they carry AU-rich elements in their mRNAs’ 3'UTR; thereafter, we have analyzed the biological effects, following PIM1, PIM3 and XIAP gene silencing experiments by migration and anchorage independent growth assays and by Annexin V/Propidium iodide staining in ln827 cell line. As far as the analysis of cell death is concerned, we observe that ZFP36 increases the number of condensed nuclei. Nevertheless all the performed assays, although confirmed an increase of cell death, never showed a convincing apoptotic pattern, suggesting that cell death triggered by ZFP36 involves a death program which is different from classical apoptosis. Studies on cell death showed that besides apoptosis and necrosis, other forms of death exist. For instance, it has been shown that genotoxic stress induces depletion of XIAP, cIAP1 and cIAP2, thereby triggering the assembly of the "Ripoptosome complex", that contains the core components RIP1, FADD, and CASP8. This complex signals both apoptotic and necroptotic cell death, independently of the activation of the TNF-receptor superfamily. We suggest that the restoring ZFP36 expression leads to down-regulation of XIAP and cIAP2 triggering ripoptosome formation and necroptosis in the absence of genotoxic stress. To this regard, we demonstrate that ZFP36-mediated RIP1 stabilization depends on cIAP2 degradation and correlates with an increase in cell death, in HEK293T cell line. Moreover, the ZFP36 expression or the presence of Etoposide (ripoptosome stabilizing drug) induces the formation of a high molecular weight complex, wherein RIP1 is more associated with CASP8, and FADD is less associated with CASP8. Taken together, these data suggest that ZFP36 determines, by stabilizing RIP1, the aggregation of a complex which might unbalance cells towards necroptosis rather than apoptosis.