Riassunto analitico
I batteri acetici (BA) sono microrganismi aerobi stretti che hanno un uso consolidato nella produzione di aceto ed alcuni di essi sono riconosciuti come generalmente sicuri per la salute umana (GRAS: generally recognised as safe). Il potenziale metabolico dei BA risiede principalmente nella loro abilità a compiere ossidazioni parziali di fonti di carbonio (zuccheri, alcoli, acidi organici e polioli), rilasciando i corrispondenti metaboliti nei mezzi circostanti. In tempi recenti ne è stato proposto l'impiego nella produzione di alimenti e bevande prebiotiche grazie alla loro capacità di sintesi di levani. Inoltre, i BA vengono utilizzati per la produzione di altri composti di interesse biotecnologico, come ad esempio intermedi di sintesi della vitamina C (acido 2-cheto-L-gulonico), acidi organici, diidrossiacetone e cellulosa. La fermentazione acetica rappresenta una fase cruciale del processo di produzione degli aceti e ad oggi non sono documentabili esempi di applicazioni industriali di ceppi di BA selezionati. Una maggiore razionalizzazione dei processi produttivi, l’ottenimento di prodotti finiti con contenuti desiderati di acido acetico, la non produzione di metaboliti indesiderati, ma anche il miglioramento dell’efficienza del processo fermentativo e la possibilità di introdurre prodotti con caratteristiche nuove, risultano allo stato attuale un’esigenza del settore industriale degli aceti. Il tema di questo lavoro di tesi è stato lo sviluppo e l’applicazione di una coltura starter selezionata di BA in sistema combinato, statico e sommerso, per la produzione di aceti innovativi. L’attività di ricerca è stata condotta nell’ambito del progetto “ACETOSCANA” - Sviluppo di aceti speciali da mosti d’uva toscani - (Misura 124 PSR 2007- 2013 Regione Toscana). Tale progetto ha come obiettivo lo sviluppo di una gamma di aceti mediante metodologie di produzione innovative. Il lavoro di tesi è stato articolato nelle seguenti fasi: 1) individuazione di un ceppo in grado di garantire la migliore performance fermentativa; 2) ottenimento di una coltura starter selezionata in sistema statico; 3) messa a punto di una fermentazione acetica in sistema sommerso pilota; 4) applicazione delle due colture starter a livello di prototipo industriale. Il ceppo UMCC 1754 appartenente alla specie Acetobacter pasteurianus è stato scelto per lo sviluppo della coltura starter grazie alle sue performance di efficienza ossidativa e per la sua stabilità genetica e fenotipica nel tempo. Lo sviluppo della coltura starter in sistema statico è stato monitorato ed eseguito lo scaling-up in accordo ai valori di etanolo ed acido acetico riscontrati nel tempo. La fermentazione acetica in sistema sommerso è stata condotta in bioreattore pilota (CETOTEC© GmbH) utilizzando come inoculo parte della coltura starter prodotta in sistema statico. Per quest’ultima fermentazione è stata necessaria la messa a punto delle fasi di start-up e di fermentazione. Le colture starter ottenute sono state impiegate per l’implementazione della fermentazione acetica in prototipo industriale. È stato inoltre adottato un sistema di controllo della persistenza del ceppo starter mediante amplificazione di elementi REP (Repetitive Extragenic Palindromic) distribuiti nel genoma batterico, che forniscono caratterizzazioni a livello intraspecifico. Mediante l’approccio descritto è stata sviluppata una coltura starter selezionata da impiegare per la fermentazione acetica in sistema statico ed in sistema sommerso. Sono stati raggiunti i parametri di fermentazione richiesti per entrambe le tipologie di fermentazione e ottenute colture starter efficienti sia in scala di laboratorio che in processi prototipali industriali. Tale approccio ha permesso inoltre di stabilire procedure e redigere protocolli per l’applicazione di colture starter selezionate di BA a livello industriale
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Abstract
Acetic acid bacteria (AAB) are strictly aerobic organisms which have a consolidated use in vinegar production and some species are recognised as GRAS (Generally Recognised as Safe) organisms.
The metabolic potential of AAB is due to their ability to perform partial oxidation of carbon sources (sugars, alcohols, organic acids and polyols), releasing the correspondent oxidation product in the surrounding media. Recently their use in the production of prebiotic food and beverages has been evaluated thanks to their ability to synthesize levans. In addition, they are used to produce a number of interesting biotechnological compounds such as intermediates of vitamin C synthesis (2-keto-L-gulonic acid), organic acids, dihydroxyacetone and cellulose. Acetic acid fermentation is a crucial step in vinegars production and hitherto there is no evidence of AAB selected starter culture application in the industry. At this time main needs of the vinegar industry are related to get a greater rationalization of production processes, to obtain finished products with desired content of acetic acid and not occurrence of unwanted metabolites, but also to improve the fermentation processes efficiency and to introduce innovative products in the market. The goal of this thesis was to develop and to apply a selected starter culture of AAB by a combined fermentation system (static and submerged) to produce new vinegars. The thesis has been developed within an activity founded by the Tuscany Region - Sviluppo di aceti speciali da mosti d’uva toscani (ACETOSCANA) - (Misura 124 PSR 2007- 2013). This project aims to develop a set of vinegars through new production methodologies. The thesis work has been structured in the following phases: 1) selection of an AAB strain able to provide a high fermentative performance; 2) development of a selected starter culture in static system; 3) set up of an acetic acid fermentation in submerged pilot system 4) application of obtained selected starter cultures in an industrial prototype system. Strain UMCC 1754 of the Acetobacter pasteurianus species has been selected to develop the starter culture due to its oxidative efficiency and phenotypic and genotypic stability during time.
The production of the selected starter culture in static system was monitored and the scaling-up was conducted accordingly to ethanol and acetic acid values. The acetic acid fermentation in submerged system was performed in a pilot bioreactor (CETOTEC© GmbH) using the selected starter culture produced in static conditions. For this latter fermentation it was necessary to set-up both start-up and fermentation steps. The obtained starter cultures were transferred to an industrial prototypal system where the acetic acid fermentation was implemented. The persistence of the selected strain has been controlled by amplification and analysis of GTG5/REP (Repetitive Extragenic Palindromic) elements, that are regions dispersed in the genome of bacteria and are used for intraspecific discrimination of strains. Through the whole described approach a selected starter culture was produced and applied in static and submerged systems. The fermentation parameters have been reached and the culture were efficient both in laboratory and prototype conditions. This approach allowed also to implement procedures and protocols to apply selected starter culture of AAB in the industry.
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