Riassunto analitico
Le infezioni virali acute dell’apparato respiratorio (ARI) sono causa significativa di morbilità e mortalità in paesi industrializzati e in via di sviluppo, soprattutto in età pediatrica e senile. Tali virus appartengono a famiglie tassonomicamente distinte ma provocano sindromi con sintomi e segni clinici spesso comuni. Pertanto, nel caso di sospetta infezione virale del tratto respiratorio, è difficile per il clinico orientarsi verso una diagnosi specifica. Una diagnosi rapida è cruciale per avviare una terapia mirata e per garantire un’adeguata gestione del paziente; inoltre, la dimostrazione di un’eziologia virale evita l’uso inappropriato di antibiotici. La recente evoluzione compiuta dalle nanotecnologie ad alto grado di automazione, fruibili nel settore della diagnostica di laboratorio, ha portato alla messa a punto di sistemi miniaturizzati, multi-parametrici, generalmente caratterizzati da elevata sensibilità; in particolare, sono disponibili sistemi basati sulla tecnologia del microarray in grado di effettuare in uno stesso campione la ricerca simultanea degli acidi nucleici di numerosi virus, appartenenti a famiglie diverse, ma comunemente coinvolti nelle ARI. Lo scopo della ricerca è stato proprio di testare l’efficacia della metodica di diagnosi virale CLART-Pneumovir. Si tratta di un’indagine molecolare di nuova generazione che ricerca gli acidi nucleici virali mediante microarray di DNA in tempi brevi. Le peculiarità di questa metodica sono l’iniziale amplificazione e la successiva ibridazione con le sonde complementari al microarray specifico fissate sulla membrana nel fondo della provetta eppendorf. Con questo sistema si è andati a valutare la prevalenza di 19 virus su campioni clinici di pazienti con ARI, già refertati con metodiche tradizionali di routine e congelati dopo averli resi anonimi per l’esecuzione in cieco del presente studio. I risultati sono stati comparati con quelli ottenuti con il percorso diagnostico di routine (che ricerca solo 10 virus), realizzato presso la SC di Microbiologia e Virologia del Policlinico. In particolare, i virus ricercati con la metodica in studio sono Adenovirus, Bocavirus, Coronavirus, Enterovirus, Virus influenzale A (sottotipi umani H3N2, N1N1 e H1N1/2009), Virus Influenzale B, Virus Influenzale C, Metapneumovirus (sottotipo A e B), Virus Parainfluenzali 1-2-3-4 (sottotipo A e B), Rhinovirus, Virus Respiratorio Sinciziale di tipo A e B. I campioni analizzati in questo studio mediante la metodica CLART-Pneumovir sono stati 140; di questi, 7 sono risultati inibiti durante l’amplificazione, per cui l’analisi finale dei dati è stata eseguita su 133 campioni. Nello specifico, i materiali analizzati sono 86 aspirati naso-faringei (ANF) e 47 lavaggi bronco-alveolari (BAL). Il protocollo CLART-Pneumovir è risultato altamente sensibile e, introdotto nelle normali metodiche di routine, potrebbe portare ad un aggiornamento dei pannelli diagnostici, ricercando sempre tutti i 19 virus. In sintesi, il metodo CLART-Pneumovir applicato ai campioni di ANF si è dimostrato efficace nel rilevare la presenza di virus respiratori. La concordanza con i metodi diagnostici di routine è risultata buona (>77%). Uno dei maggiori vantaggi di questo sistema è quello di consentire simultaneamente la ricerca di un pannello molto ampio di virus, permettendo così di evidenziare molte più infezioni multiple rispetto ai metodi tradizionali. Va inoltre sottolineato l’impatto che questo approccio diagnostico rapido potrebbe avere in termini di contrazione dei tempi di degenza e quindi dei costi ospedalieri legati al prolungamento dell’ospedalizzazione, spesso correlati alla mancanza e/o alla lentezza di diagnosi. Sulla base dei dati ottenuti, l’eventuale introduzione di questa metodica nella pratica diagnostica dovrebbe però essere considerata, al momento, solo per i campioni ANF.
|
Abstract
Acute viral infections of the respiratory tract (ARI) are a significant cause of morbidity and mortality both in industrialized and in developing countries. They mainly affect children and elderly people. These viruses belong to different taxonomical families but they cause syndromes characterized by undifferentiated clinical symptoms and signs. Therefore, in the case of suspected viral infection of the respiratory tract, it is difficult for the clinician to guide the path towards a specific laboratory diagnosis. A rapid diagnosis is crucial to initiate a targeted therapy and to ensure appropriate management of the patient. Moreover, the assesment of a viral etiology avoids the inappropriate use of antibiotics.
The recent changes made by the high degree of automation of the nanotechnologies, which are available in the field of laboratory diagnostics, has led to the development of miniaturized, multi-parametric systems, generally characterized by high sensitivity. In particular, there are systems based on microarray technology able to perform in the same sample the simultaneous search of the nucleic acids of numerous viruses, belonging to different families, but commonly involved in the ARI.
The purpose of this research was to test the effectiveness of a viral diagnostic method named CLART-Pneumovir. This is a new generation molecular test to search for viral nucleic acids by DNA microarray in a short time. This method consists of an initial amplification followed by hybridization of the generated amplicons with probes on a microarray located at the bottom of an eppendrof microtube.
Our research assessed the prevalence of ARI 19 virus in clinical specimens which had undergone already routine diagnosis by traditional virological methods. After being processed, the samples were frozen and made anonymous for the execution of this blinded study. The results were compared with those obtained using the diagnostic routine procedures able to detect only 10 viruses, carried out at the SC of Microbiology and Virology of the Policlinico.
In particular, the virus detectable by our method are: Adenovirus, Bocavirus, Coronavirus, Enteroviruses (Echovirus), Influenza virus A (Human subtypes H3N2, N1N1 and H1N1/2009), Influenza virus B, Influenza virus C, Metapneumovirus (subtype A and B), Parainfluenza virus 1 - 2 - 3 - 4 (subtype A and B), Rhinovirus, Respiratory Syncytial virus type A and type B.
The samples analyzed in this study using the method CLART-Pneumovir were 140, 7 of which were inhibited during amplification, so that the final data analysis was performed on 133 samples. Specifically, the analyzed materials were 86 nasopharyngeal aspirates (ANF) and 47 bronchoalveolar lavages (BAL).
The protocol CLART-Pneumovir was highly sensitive and if introduced into the normal routine methods, could lead to a signficant enlargement of the diagnostic panel, always searching for all 19 viruses.
To conclude, the method CLART-Pneumovir applied to samples of ANF has been proven effective in detecting the presence of respiratory viruses. In addition, the comparison with the results of the routine diagnostic methods was good (>77%). One of the most significant advantages is essentially the simultaneous search for a very large panel of viruses allowing the detection of a high number of multiple infections.
It should also be highlighted that the impact of this rapid diagnostic approach might have in terms of reduction of hospital stay and hospital costs, often related to the lack and/or the slowness of an etiological diagnosis.
Based on the data obtained, the possible introduction of this method in diagnostic practice, however, should be considered at the time, only for samples of ANF.
|