Riassunto analitico
Legionella spp sono batteri diffusi negli ambienti acquatici naturali e nei sistemi idrici artificiali, dove si moltiplicano all’interno di protozoi e sopravvivono come forme a vita libera o associate a biofilm. La trasmissione delle legionelle all’uomo avviene per inalazione di aerosol contaminati ed in soggetti suscettibili può dare origine ad una forma simil-influenzale detta Febbre di Pontiac o ad una polmonite acuta conosciuta come Malattia dei Legionari. Questa severa forma di polmonite, sostenuta nella quasi totalità dei casi dalla specie L. pneumophila, ha un tasso di mortalità del 15-20% che può raggiungere il 50% nei soggetti immunocompromessi. Lo sviluppo di metodi rapidi e sensibili per il rilevamento e la quantificazione di Legionella spp. è essenziale per il monitoraggio della qualità delle acque e la prevenzione della legionellosi. Il metodo colturale è considerato il metodo di riferimento per la ricerca e quantificazione di legionelle. Questa metodica è l’unica che permette di isolare e tipizzare i ceppi di Legionella per risalire alla sorgente di infezione in caso di epidemie. Tuttavia, la coltura richiede periodi di incubazione prolungati non compatibili con la necessità di intervenire rapidamente in situazioni di emergenza. Inoltre, non consente di rilevare lo stato vitale ma non coltivabile delle cellule (VBNC), condizione sviluppata da alcuni patogeni opportunisti, come appunto Legionella, per sopravvivere in situazioni ambientali sfavorevoli. In questo stato, i batteri perdono la capacità di formare colonie sui convenzionali terreni di coltura e nonostante i bassi livelli di attività metabolica mantengono le caratteristiche di virulenza. Per superare i limiti della metodica colturale sono state sviluppate tecniche molecolari come la PCR e soprattutto la real-time PCR (qPCR), che mostrano elevata sensibilità ed accuratezza, permettono di ottenere risultati in tempi brevi ed evidenziano anche la presenza delle cellule VBNC. Tuttavia, il principale svantaggio di questi metodi è che non distinguono tra cellule vitali e cellule morte. Per superare questo limite, negli ultimi anni sono stati proposti altri metodi molecolari che utilizzano in combinazione con la qPCR un intercalante del DNA che impedisce l’amplificazione delle cellule non vitali. In questo contesto, il nostro studio ha l’obiettivo di valutare l’applicabilità di un kit di estrazione e quantificazione di DNA in qPCR per la ricerca di Legionella spp in campioni ambientali. L’aspetto innovativo di questo kit consiste nell’uso di membrane filtranti in grado di lasciare passare le molecole di DNA derivanti da cellule morte evitandone così l’amplificazione nella fase successiva di PCR. Lo studio si propone di verificare l’affidabilità e la riproducibilità dei risultati ottenuti mediante il confronto con il metodo colturale classico e l’analisi eseguita in doppio con un altro laboratorio. L’efficacia di questo kit nella rilevazione e quantificazione di cellule vitali di Legionella spp è stata valutata sia in campioni contaminati artificialmente che in campioni prelevati in sistemi idrici sottoposti a diversi trattamenti di disinfezione. L’utilizzo di questo metodo nel monitoraggio degli impianti di distribuzione dell’acqua potrebbe contribuire ad accrescere le conoscenze circa il reale rischio di esposizione a Legionella spp., permettendo così di ottimizzare le strategie di controllo adottate.
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Abstract
Legionella organisms are ubiquitous bacteria found in many types of water sources in the environment and their growth is especially favoured in human-made warm water systems. Legionella bacteria replicate as intracellular parasites of amoebae and persist in the environment as free-living microbes or in biofilms. Infection occurs after inhalation of Legionella-contaminated water droplets, formed from aerosol-generating devices. In aerosol form, they enter the lungs and can cause an acute form of pneumonia known as Legionnaires’ disease or a milder form of infection called Pontiac fever. The species L. pneumophila is responsible for the vast majority of the most severe form of this atypical pneumonia. Legionellosis outbreaks are associated with high mortality rates (15 to 20%), which can reach up to 50% among individuals with immune deficiencies. The development of rapid and sensitive methods for the detection and quantification of Legionella spp is essential for monitoring water quality and for legionellosis prevention. Cell culture is the reference method to detect and quantify legionellae. Culture is essential for identifying and typing Legionella strains during epidemics. However, Legionella culture requires long incubation times before results can be scored. This problem makes culture unsuitable for preventive actions and rapid response in emergency situations. Moreover, the Viable But NonCulturable (VBNC) cells are not detectable by culture. The VBNC state is developed by some opportunistic pathogens such as Legionella to survive in unfavourable environmental conditions. The VBNC cells are still alive and retain their virulence. In an attempt to overcome these disadvantages, molecular investigation tools such as Polymerase Chain Reaction (PCR) and especially quantitative PCR (qPCR) were developed. PCR techniques show several advantages including high sensitivity, accuracy and rapid evaluation of germ contamination; nevertheless, the main disadvantage of these molecular methods is that they don’t distinguish between dead and viable cells. A new approach to detect viable cells by DNA-intercalating dyes in combination with qPCR has been proposed over the last ten years. This molecular technique prevents amplification of DNA from dead cells.
The aim of our present study was to verify the applicability of a Legionella spp DNA extraction and quantification kit in real-time PCR to analyse environmental samples. This innovative kit is based on the use of membrane filters that allow to not retain any DNA deriving from dead cells present in the water sample. In this way only DNA from viable cells can be amplified and quantified. To evaluate the reliability of the kit, the results were compared with those obtained by conventional culture. Water samples were also analysed by two laboratories to verify the reproducibility of this method. The effectiveness was proven both in liquid pure cultures of L. pneumophila and in natural water samples treated with different disinfection systems. This method may significantly improve the knowledge about the exposure risk to these bacteria, allowing us to optimize the selection of the more appropriate disinfection strategies.
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