Riassunto analitico
I polifenoli sono antiossidanti naturali presenti nelle piante, importanti per prevenire l’ossidazione delle lipoproteine e nel neutralizzare i radicali liberi. Si tratta di composti organici che contengono almeno un gruppo ossidrilico legato ad un anello aromatico ed un gruppo carbossilico. Gli acidi idrossicinnamici sono un tipo di composti fenolici ampiamente distribuito nel mondo vegetale, il cui principale rappresentante in natura è l’acido clorogenico (C-QA) . Dal punto di vista chimico si tratta di un estere formato da acido caffeico (CA) ed acido chinico (QA). L’interesse nei confronti dell’acido clorogenico deriva dal fatto che studi in vitro mostrano come questa molecola, insieme all’acido caffeico, è in grado di proteggere dallo stress ossidativo e presenta attività antibatterica ed antivirale.
Il caffè, una delle bevande più consumate al mondo, rappresenta una ricchissima fonte di acido clorogenico. Il C-QA è poco assorbibile dalle cellule intestinali ma, una volta giunto a livello del colon, subisce un processo di idrolisi che porta alla formazione di diversi metaboliti di più facile assorbimento. In questo lavoro di tesi è stata valutata la conversione dell’acido clorogenico da parte del microbiota intestinale di nove soggetti diversi (sei uomini e tre donne) al fine di valutare il diverso metabolismo batterico del nostro composto d’interesse. A tal fine, sono stati effettuati esperimenti di bioconversione utilizzando resting cells di colture fecali con aggiunta di acido clorogenico, e analizzando successivamente mediante HPLC-MS i surnatanti raccolti per identificare e quantificare i metaboliti prodotti.
L’analisi dei campioni da resting cells tramite HPLC-MS, condotta presso il laboratorio del CEBAS (Murcia, Spagna), ha permesso l’identificazione di dieci diversi metaboliti, portando alla individuazione di diverse pathway di degradazione. A partire dall’acido clorogenico, possono avvenire diverse reazioni come deidrossilazione, deesterificazione e idrogenazione. Queste reazioni sono tra loro competitive ma convergono sullo stesso prodotto, l’acido 3-idrossifenilpropionico (HPPA). Parte di questo subisce ulteriori trasformazioni, il cui prodotto più semplice è l’acido fenilacetico.
In seguito, Bifidobacterium animalis subsp. lactis WC 0432, un ceppo potenzialmente probiotico e in grado di idrolizzare l’acido clorogenico in acido caffeico, è stato aggiunto a fermentazioni in continuo di microbiota intestinale, per valutarne la capacità di influenzare il metabolismo dell’acido clorogenico in un modello in vitro dell’ecosistema intestinale. I processi fermentativi di microbiota e acido clorogenico, con o senza l’aggiunta del ceppo probiotico, sono stati regolarmente campionati e sottoposti a diverse analisi. L’isolamento di bifidobatteri su terreno selettivo (RB) e la successiva caratterizzazione tramite PCR-RAPD ci ha consentito di monitorare e confermare la sopravvivenza del ceppo probiotico durante la fermentazione. Sono state condotte anche analisi FISH (Fluorescent in situ Hybridization) per valutare la quantità totale di batteri e quantificare i principali gruppi batterici come Bacteroides, Bifidobacteria, Enterobacteriaceae, cluster XIVa dei Clostridiales, e Faecalibacterium prausnitzii e HPLC-RID per monitorare la produzione di acidi organici nel corso della fermentazione. La presenza del ceppo Bifidobacterium animalis subsp. lactis WC 0432 determina delle variazioni nella composizione del microbiota e nella sua attività metabolica, senza peraltro modificare significativamente il destino del C-QA. In particolare promuove la crescita di Faecalibacterium prausnitzii e dei clostridiali del cluster XIVa, con un importante incremento del butirrato prodotto, metabolita fondamentale per la salute dei colonociti umani.
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