• FIBROSI POLMONARE
• HOXB7
• INTERSTIZIOPATIA
• IPF
• MSC

ABSTRACT
INTRODUZIONE
La fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è una pneumopatia infiltrativa diffusa (PID) cronica, progressiva ad eziologia ignota con sopravvivenza mediana alla diagnosi di circa 2-4 anni. Le interazioni tra deficit rigenerativi delle cellule alveolari, senescenza tissutale e alterato equilibrio tra fattori profibrotici e antifibrotici giocano un ruolo chiave nella patogenesi della malattia e nella sua progressione. Tra i vari protagonisti coinvolti nell’esordio della patologia assumono un ruolo fondamentale i miofibroblasti che, stimolati da bFGF e TGF-β, producono matrice extracellulare in misura aberrante portando alle degenerazioni fibrotiche tipiche dell’IPF. Le cellule stromali mesenchimali (MSC) polmonari sono la fonte principale da cui derivano queste cellule. È stato osservato che nel tumore polmonare non a piccole cellule questo processo di differenziazione è legato alla espressione del gene HOXB7 (Homeobox protein B7). In questa ottica si è ipotizzato che HOXB7 possa giocare un ruolo importante nel promuovere la proliferazione dei miofibroblasti a partire dalle MSC polmonari, favorendo in questo modo uno dei meccanismi chiave del processo fibrosante.
OBIETTIVI DELLO STUDIO
L’obiettivo primario dello studio è quello di confrontare i livelli di espressione della proteina HOXB7 nel tessuto polmonare di pazienti con diagnosi istologica di IPF rispetto a pazienti non affetti da fibrosi polmonare. Obiettivo secondario è correlare l’espressione di HOXB7 alla gravità della patologia al momento della diagnosi istologica.
MATERIALI E METODI
Dal Database IPF di Modena sono stati selezionati in maniera retrospettiva dieci pazienti con diagnosi bioptica di IPF e sono stati analizzati i corrispettivi campioni bioptici polmonari. I campioni utilizzati erano stati fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE). Come controlli sono stati selezionati tre pazienti con diagnosi di cancro polmonare e nessuna evidenza di fibrosi polmonare su biopsia polmonare chirurgica. Per determinare la severità della malattia è stato utilizzato l’indice GAP (gender, age, pulmonary function), calcolato al momento della biopsia polmonare chirurgica. Per tutti i campioni è stato svolto un esame immunoistochimico (IHC) con anticorpi specifici per HOXB7 e i livelli di espressione della proteina HOXB7 sono stati quantificati attraverso il Deconvolution 2 plugin su 20 campi differenti di ogni immagine IHC. Per confrontare i dati sono stati utilizzati il test T di Student e l’analisi della varianza (ANOVA) con un test post-hoc di Dunn multipli. I livelli di espressione di HOXB7 sono stati correlati all’indice di GAP tramite il coefficiente di correlazione di Pearson. La significatività statistica è stata posta a 0,05.
RISULTATI
I risultati delle analisi immunoistochimiche hanno mostrato che il valore complessivo dell’intensità di segnale dell’espressione di HOXB7 era più alto nei pazienti affetti da IPF (mediana:23259 procedure defined units [p.d.u], interquartile range [IQR]:17566-74703 p.d.u) rispetto i controlli (mediana:9784 p.d.u, IQR:8926- 30456 p.d.u, p<0.0001). Otto dei dieci pazienti mostravano una over-espressione di HOXB7 rispetto il valore medio dell’intensità di espressione di HOXB7. Inoltre, la severità della malattia, espressa tramite l’indice GAP, risulta essere strettamente correlata ai livelli di espressione della proteina HOXB7 (r=0.8, p=0.01).
CONCLUSIONI
HOXB7 sembra quindi essere maggiormente espresso nei polmoni dei pazienti affetti da IPF e i suoi livelli di espressione paiono correlati alla gravità della malattia. Ulteriori studi di trascrittomica e proteinomica sui livelli di espressione di HOXB7 sono necessari per chiarire e comprendere meglio il suolo svolto da HOXB7 sull’insorgenza e sulla progressione dell’IPF

ABSTRACT BACKGROUND Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF) is a chronic, progressive, fibrosing interstitial lung disease (ILD) of unknown etiology, with a median survival of 3 years from the time of diagnosis and no available therapies of proven efficacy. The interplay between alveolar cell regenerative deficits, tissue senescence and imbalance between pro-fibrotic and anti-fibrotic mediators is supposed to play a key role among the mechanisms governing fibrosis onset and progression. In this scenario, the myofibroblasts resulted the key effector cells of IPF, being stimulated by bFGF or TGFbeta to produce excessive extracellular matrix that increases lung structural rigidity and reduces alveolar gas exchange. Resident lung mesenchymal stromal cells (MSCs) resulted the main source of myofibroblasts, whose differentiation from stem cell progenitors was associated with Homeobox protein B7 (HOXB7) gene –a gene encoding for a nuclear transcription factor involved in cell proliferation and development– expression in non-small cell lung cancer. In this line, a potential role of HOXB7 in promoting myofibroblast proliferation from lung resident MSCs, thus favoring the onset of pulmonary fibrosis, has been hypothesized. OBJECTIVES With this proof of concept study we aimed at comparing the expression level of HOXB7 protein in patients with IPF as compared to patients without lung fibrosis. Moreover, we analyzed the correlation between HOXB7 protein expression and the severity of IPF. METHODS Ten patients with established diagnosis of IPF from surgical lung biopsies were retrospectively selected among the Modena IPF Database and the related lung histological formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) specimens were analyzed. Three patients with established diagnosis of lung cancer and no evidence of lung fibrosis from surgical lung biopsies served as controls. IPF severity was assessed through the Gender Age Pulmonary Function (GAP) index calculated at the time of surgical lung biopsy. Immunohistochemistry (IHC) assay with HOXB7 specific antibody was performed for all specimens and the expression level of the HOXB7 protein was quantified through Deconvolution 2 plugin on 20 different fields for each IHC image. T student test and ANOVA analysis with post-hoc Dunn multiple tests were used for comparison. The expression level of HOXB7 protein was correlated with GAP index by means of Pearson correlation coefficient. Statistical significance was set at 0.05. RESULTS According to the IHC quantification, the overall expression of HOXB7 intensity signal value was higher in IPF patients (median = 23259 procedure defined units [p.d.u], interquartile range [IQR] = 17566-74703 p.d.u) than in controls (median = 9784 p.d.u, IQR = 8926- 30456 p.d.u, p<0.0001). Eight out 10 IPF patients over-expressed HOXB7 protein as compared to the average HOXB7 intensity signal value of controls. The expression of HOXB7 protein resulted significantly associated with the severity of IPF as expressed by GAP index (r=0.8, p=0.01). CONCLUSIONS HOXB7 seems overexpressed in the lung of patients with IPF, begin correlated with disease severity. Further investigations on HOXB7 expression at transcriptomic and proteomic level are needed to clarify its role in the onset and progression of IPF.