Riassunto analitico
I microRNA sono regolatori chiave dell’espressione genica che controllano il destino delle cellule staminali attraverso la down-regolazione post-trascrizionale di centinaia di geni target mediante appaiamento alla regione 3’ non tradotta degli mRNA. Infatti, i miRNA regolano finemente alcuni processi fondamentali delle cellule staminali, come il self-renewal, la proliferazione e il differenziamento; in particolare, l’espressione di diverse combinazioni di miRNA può identificare precisamente specifici tipi cellulari e regolare le diverse fasi del differenziamento cellulare. Di conseguenza, la deregolazione dell’espressione dei miRNA può contribuire in modo significativo allo sviluppo di tumori solidi e neoplasie ematologiche. L’espressione di miR-382-5p risulta essere up-regolata in pazienti con neoplasie mieloidi, quali la Leucemia Promielocitica Acuta (Acute Promyelocytic Leukemia – APL) e la Mielofibrosi Primaria (Primary Myelofibrosis – PMF); ciononostante il suo ruolo nella ematopoiesi normale è ancora sconosciuto. In questo lavoro di tesi, allo scopo di caratterizzare il ruolo di miR-382-5p nel differenziamento mieloide, abbiamo valutato gli effetti dell’overespressione del miRNA sul commitment di cellule staminali/progenitori ematopoietici CD34+ (Hematopoietic Stem/Progenitor Cells – HSPCs) purificate da sangue di cordone ombelicale, mediante la nucleofezione di miRNA mimic, capaci di mimare l’attività del miRNA endogeno. L’overespressione di miR-382-5p in cellule CD34+ porta ad un calo significativo dei precursori megacariocitari e al contemporaneo aumento di quelli granulocitari come dimostrato dall'analisi immunofenotipica dei marcatori di differenziamento megacariocitari e granulocitari, dalle analisi morfologiche di citocentrifugati e dai saggi clonogenici in collagene e metilcellulosa. In seguito, per mezzo di un’analisi computazionale utilizzando diversi algoritmi di predizione, abbiamo identificato diversi putativi mRNA target di miR-382-5p che sono down-regolati in seguito all’overespressione del miRNA (i.e. FLI1, GATA2, MAF, MXD1, RUNX1 e SGK1). Tra questi, mediante l’uso di un saggio di luciferasi abbiamo validato MXD1 come un target effettivo di miR-382-5p. Infine, abbiamo silenziato l’espressione di MXD1 in cellule CD34+ mediante nucleofezione di un pool di 3 siRNA che targettano esoni diversi e abbiamo osservato come gli effetti sul differenziamento granulocitario e megacariocitario delle cellule CD34+ siano perfettamente sovrapponibili a quelli ottenuti in seguito all’overespressione di miR-382-5p. Complessivamente, i nostri risultati dimostrano che l’espressione di miR-382-5p favorisce l’espansione del lineage granulocitario e riduce il commitment megacariocitario attraverso la down-regolazione di MXD1. Pertanto, i nostri dati mostrano per la prima volta, come l’asse miR-382-5p/MXD1 giochi un ruolo critico nella mielopoiesi influenzando la scelta del lineage differenziativo delle cellule staminali ematopoietiche CD34+.
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Abstract
MicroRNAs are key regulators of gene expression that control stem cell fate by post-trascriptional down-regulation of hundreds of target genes via seed-pairing in their 3’ untraslated region. In fact, miRNAs tightly regulate fundamental stem cell processes, like self-renewal, proliferation and differentiation; in particular, the combinatorial expression of miRNAs can precisely characterize specific cell types and regulate different phases of differentiation. Consequently, miRNA deregulation may contribute significantly to the development of solid tumours and haematological malignancies.
Mir-382-5p has been found to be upregulated in patients with myeloid neoplasms, in particular in Acute Promyelocytic Leukemia (APL) and in Primary Myelofibrosis (PMF); despite this, its role in normal hematopoiesis is still unknown.
In this thesis, in order to characterize the function of miR-382-5p in myeloid differentiation, we evaluated the effects of its overexpression on the commitment of human CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) purified from umbilical cord blood, by nucleofection with miRNA mimic, capable of mimicking the activity of the endogenous miRNA. MiR-382-5p overexpression in CD34+ hematopoietic cells leads to a significant decrease of megakaryocyte precursors coupled to increase of granulocyte ones as demonstrated by immunophenotypic analysis of megakaryocyte and granulocyte differentiation markers, by morphological analysis of cytospins and by methylcellulose and collagen clonogenic assays.
Afterwards, by means of a computational analysis using different prediction algorithms, we identified several putative mRNA targets of miR-382-5p that are downregulated upon miRNA overexpression (i.e. FLI1, GATA2, MAF, MXD1, RUNX1 and SGK1). Among these, we validated MXD1 as real target of miR-382-5p by luciferase reporter assay.
Finally, we silenced the expression of MXD1 in CD34+ cells by nucleofection of a mix containing 3 siRNA targeting different exons and we observed that the results mimics the effects of miR-382-5p overexpression on granulocyte and megacaryocyte differentiation of CD34+ cells.
Overall, our results demonstrated that miR-382-5p expression favours the expansion of granulocyte lineage and impairs megacaryocyte commitment through MXD1 down-regulation.
Therefore, our data showed for the first time that the miR-382-5p/MXD1 axis plays a critical role in myelopoiesis by affecting the lineage choice of CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells.
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