Riassunto analitico
Le cellule interagiscono con l’ambiente grazie a circuiti di trasduzione del segnale, tra cui quello dei fosfoinositidi (PI), in cui sono coinvolte, le fosfolipasi C PI-specifiche (PLC). Nei mammiferi le PLC sono 13 isoenzimi classificati in 6 sottofamiglie: β (1-4), γ (1-2), δ (1,3,4), ε, ζ e η (1-2), classificate in base a peculiarità strutturali, sequenza amminoacidica e meccanismi di attivazione. Le PLC si possono trovare legate alla membrana, secrete in vescicole o in forma libera nella cellula. La funzione principale è modulare la risposta fisiologica, ma ogni enzima ha anche specificità legate a tipo di tessuto, localizzazione e distribuzione cellulare, strettamente cellula/tessuto-specifica. Le PLC idrolizzano il fosfatidilinositolo 4,5 bifosfato (〖PIP〗_2) in due secondi messaggeri: inositolo 1,4,5 trifosfato (〖IP〗_3) e 1,2 diacilglicerolo (DAG). Il sistema è modulato dal calcio, sia intracellulare che extracellulare. Il tessuto osseo è soggetto a continuo rimodellamento, essenziale per l’omeostasi ossea, in cui gli osteoblasti (OB) rivestono un ruolo importante. Il metabolismo e il differenziamento degli OB è influenzato da varie vie, in particolare quelle legate al calcio, tra cui quella mediata dalle PLC. Nella presente tesi sperimentale abbiamo studiato la variazione dell’espressione e della localizzazione delle PLC in colture di OB umani quiescenti e in differenziamento mediante tecniche di biologia molecolare (RT-PCR) e di immunocitochimica (IF). Gli OB sono stati studiati a diversi timepoint: 0, 3, 10, 17 e 23 giorni. Al giorno 0 tutti i geni che codificano sono espressi eccetto PLCB, presente a partire dal giorno 3. I geni PLCB1, PLCB4 e PLCH2 sono espressi con una doppia banda in entrambe le condizioni sperimentali. Tuttavia, negli OB in differenziamento al giorno 23 l’espressione dei geni PLCB1 e PLCH2 cambia, presentano una singola banda, ed i geni PLCB4, PLCD1, PLCD4 e PLCDE risultano assenti. La localizzazione delle PLC cambia nelle due condizioni sperimentali. Al giorno 0 di coltura, PLCβ2, γ1, γ2 sono localizzate a livello perinucleare, PLCβ3, δ4, ε, η1 e η2 nel citoplasma, PLCβ1 e η2 nel nucleo. PLCδ1 e δ3 sono debolmente presenti nel citoplasma. Negli OB quiescenti PLCβ2, β3, β4, γ1, γ2, δ1 e δ3 e ε si trovano nel citoplasma, alcune occasionalmente con distribuzione puntuata o filamentosa, e nei prolungamenti cellulari. PLCη1 e η2 si spostano alternativamente tra nucleo e citoplasma, dal giorno 10 si distribuiscono anche nei prolungamenti. PLCη1 al giorno 3 è visibile in una struttura podosome-like. In entrambe le condizioni, inizialmente, PLCβ1 mantiene localizzazione nucleare e citoplasmatica, dopo si sposta esclusivamente nel citoplasma. Negli OB in differenziamento, inizialmente PLCγ2, δ1, δ3 si localizzano sia a livello nucleare che citoplasmatico, successivamente PLCγ2 e δ1 si spostano in area perinucleare, PLCδ3 nel citoplasma. PLCβ2, β3, β4, γ1, δ4, ε e η1 rimangono prevalentemente nel citoplasma con distribuzione per lo più puntuata. PLCη2 inizialmente si localizza sia nel nucleo di alcune cellule che in area perinucleare, poi nel citoplasma. In entrambe le condizioni sperimentali, la distribuzione di PLCη1 e η2 nel citoplasma è puntuata e quella di PLCε è molto abbondante, indipendentemente dalle condizioni sperimentali. I risultati di questo studio dimostrano che l’espressione dei PLC geni cambia a seconda della condizione sperimentale. La localizzazione di specifici enzimi (PLCβ1, γ2, δ1, δ3, η1 e η2) trasloca alternativamente da nucleo e citoplasma nelle due condizioni sperimentali. Inoltre negli OB quiescenti PLCη1 si localizza in strutture podosome-like non descritte negli OB in differenziamento.
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