• bacterial peroxidase
• biochemistry
• characterization
• cytochrome c-type
• N. gonorrhoeae

Neisseria gonorrhoeae è un patogeno umano obbligato che causa la gonorrea, una malattia trasmessa sessualmente, che infetta ogni anno milioni di persone in tutto il mondo.
Durante l'infezione, al fine di far fronte allo stress ossidativo dovuto al perossido di idrogeno (H2O2), una delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) generata dai meccanismi di difesa dell'ospite, N. gonorrhoeae utilizza il citocromo c perossidasi (NgCCP), una lipoproteina della membrana esterna, che catalizza la riduzione del perossido di idrogeno in acqua.
La forma solubile di questo enzima e il putativo donatore di elettroni, il citocromo c2 di N. gonorrhoeae, sono stati eterologamente espressi in E. coli BL21(DE3) e isolati dal suo periplasma attraverso diversi protocolli cromatografici di purificazione. Il citocromo c perossidasi di N. gonorrhoeae è stato purificato utilizzando una cromatografia di affinità seguita da una cromatografia di filtrazione gel.
Dal momento che questo piccolo citocromo non era mai stato né isolato né biochimicamente caratterizzato prima, questa tesi è focalizzata sul citocromo c2.
La procedura di isolamento del citocromo c2 è stata eseguita attraverso due diversi protocolli, ossia erano una cromatografia di affinità seguita da una cromatografia di scambio cationico come prima procedura di purificazione, e una cromatografia di scambio cationico seguita da una cromatografia di esclusione molecolare come seconda procedura di purificazione.
Il metodo Lowry e il metodo pyridine-hemocromogen sono stati utilizzati rispettivamente per la quantificazione della proteina e dell’eme per determinare il rapporto eme/proteina pari a 0,6.
Diverse tecniche spettroscopiche sono state utilizzate per la caratterizzazione biochimica del citocromo c2. In particolare, lo stato di ossidazione della proteina è stato esaminato dal suo spettro di assorbimento UV-visibile e la resa del citocromo c2 di N. gonorrhoeae purificato è stata calcolata misurando l'assorbimento nello stato come isolato a 410.5 nm della banda Soret, con 410.5 nm = 116 mM-1cm-1 come coefficiente di estinzione molare. La prima procedura di purificazione ha avuto un rendimento pari a 1,63 mg/mL, mentre la seconda aveva un rendimento di 1,05 mg/mL e tali procedure di isolamento sono state esaminate mediante analisi comparativa.
Lo spettro 1H-NMR ha permesso di valutare il folding della proteina e la sfera di coordinamento. La risonanza a -3,39 ppm è stata attribuita al metile di un residuo di metionina. La tecnica del dicroismo circolare ha permesso di stimare la struttura secondaria, l'interazione matrice-eme della proteina e alcuni parametri termodinamici, come l’entalpia di denaturazione (H) risultante pari a 156,7 kJ/mol e la temperatura di denaturazione (TM) pari a 60,6 °C del citocromo c2. I dati risultanti erano coerenti con lo spettro di assorbimento nell’UV-visibile e con l'analisi dell’allineamento delle sequenze omologhe, che hanno identificato la metionina in posizione 71 (Met71) come conservata e, quindi, poteva essere proposta come ligando assiale del ferro dell’eme.
Uno studio di cinetica sul citocromo c2 di N. gonorrhoeae in presenza del citocromo c perossidasi è stato eseguito perossidasi monitorando l'ossidazione del citocromo c2 ed ha rivelato l'attività perossidasica, come ci si aspettava. Tuttavia, la procedura del saggio performato richiede un’ulteriore ottimizzazione perché il citocromo c2 risultava comunque ossidato durante il test, probabilmente a causa di una seppur minima quantità di ossigeno molecolare (O2). D’altro canto, è stato possibile osservare una piccola ri-ossidazione del citocromo all’aggiunta di NgCCP, indicando che il citocromo c2 potrebbe essere un possibile elettron-donatore di questo enzima.

Neisseria gonorrhoeae is an obligate human pathogen that causes the sexually transmitted disease gonorrhea, that infects each year millions of people worldwide. During infection, reactive oxygen species (ROS) is generated by host defense mechanisms due to the hydrogen peroxide (H2O2), and in order to cope with the oxidative stress, N. gonorrhoeae uses the cytochrome c peroxidase (NgCCP), an outer membrane lipoprotein, that catalyzes the reduction of hydrogen peroxide to water. The soluble form of this enzyme and the putative electron donor N. gonorrhoeae cytochrome c2, were heterologously expressed in E. coli BL21(DE3) and isolated from its periplasm through different chromatographic purification protocols. The N. gonorrhoeae cytochrome c peroxidase was purified using an affinity chromatography followed by a gel filtration chromatography. Since this small cytochrome had never been isolated nor biochemically characterized before, this thesis focused on cytochrome c2. The isolation procedure of the cytochrome c2 was carried out through two different steps, consisting in an affinity chromatography followed by a cationic exchange chromatography as first purification procedure, and a cationic exchange chromatography followed by a gel filtration chromatography as second purification procedure. The Lowry method and pyridine-hemochromogen method was used for the protein and heme quantification, respectively, to determinate the number of heme/protein equal to 0.6. Several spectroscopic techniques were used in order to biochemically characterize the N. gonorrhoeae cytochrome c2. Specifically, the oxidation state of the protein was examined by its UV-visible absorption spectroscopy and the yield of the purified N. gonorrhoeae cytochrome c2 was calculated measuring the absorbance in the as-isolated state at 410.5 nm of Soret band, with 410.5nm=116 mM-1cm-1 as coefficient of molar extinction. The first purification procedure had a yield of 1.63 mg/mL, while the second one had a yield of 1.05 mg/mL and these isolation procedures were investigate by comparative analysis. The 1H-NMR spectrum assessed the folding of protein and the coordination sphere. The resonance at -3.39 ppm was attribute to the ε-methyl of a methionine residue. The circular dichroism technique allowed to estimate the secondary structure, the protein matrix-heme interaction and thermodynamic parameters, such as the denaturation enthalpy (ΔH) as 156.7 kJ/mol and the melting temperature (TM) as 60.6 °C, of the cytochrome c2.The resulting data were consistent with the UV-visible absorption spectrum and with the analysis of the aligned homology sequences, that identified the methionine at 71 position (Met71) as conserved and, thus, could be proposed as heme-iron distal ligand. A kinetic study on cytochrome c2 of N. gonorrhoeae in the presence of cytochrome c peroxidase was performed by monitoring the oxidation of cytochrome c2 and revealed peroxidic activity, as expected. However, the procedure of the performed test requires further optimization because the cytochrome c2 was still oxidized during the test, probably due to a small amount of molecular oxygen (O2). On the other hand, it was possible to observe a small re-oxidation of the cytochrome c2 to the addition of NgCCP, indicating that cytochrome c2 could be a possible electron-donor of this enzyme.